[發明專利]一種表達高特異性β環糊精糖基轉移酶的基因工程菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201811617619.1
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109706131A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 張洪斌;花敬涵;楊靜文;胡雪芹
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/18;C12P19/04
• 代理公司: 合肥國和專利代理事務所(普通合伙) 34131
• 代理人: 孫永剛

本發明公開了一種表達高特異性β環糊精糖基轉移酶的基因工程菌及其構建方法和應用，涉及一種基因工程菌。本發明的基因工程菌是以質粒cgt/pET?22b為模板，經定點突變后得到突變體A47S、A47M、A47Y、A47R，并于宿主菌E.Coli BL21中轉化得到的E.coli BL21(DE3)/A47S、E.coli BL21(DE3)/A47M、E.coli BL21(DE3)/A47Y、E.coli BL21(DE3)/A47R，本發明的工程菌有效提高了來源于Bacillus cereus的β?CGTase酶的產物特異性，為其更好的應用于β?環糊精的工業化生產提供了一定的基礎。

技術領域

本發明涉及一種基因工程菌，尤其涉及一種表達高特異性β環糊精的葡萄糖 糖基轉移酶基因工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

環糊精(CDs)是由6至超過100個葡萄糖單元組成的環狀葡聚糖，常見的 有α-、β-、γ-CD(對應的葡萄糖基單元數目分別為6、7、8)。CDs含有獨特的疏 水空腔，可與疏水性小分子形成包合物。這種獨特的性質使CDs能夠與許多難 溶性藥物形成水溶性包合復合物，增強藥物的水溶性，并改善藥物的穩定性及生 物利用度，是理想的藥物輔料，被應用于水性腸胃外溶液、鼻噴霧劑和滴眼液等 35種藥物產品中。CDs在食品、農業和化妝品等領域也有廣泛的應用。

環糊精糖基轉移酶(CGTase)(EC 2.4.1.19)屬于糖基水解酶的α-淀粉酶家 族(13家族)，是催化淀粉或其他多糖中α-1,4鍵裂解成CDs的細胞胞外酶。 CGTase可以催化四種反應：環化(直鏈淀粉或支鏈淀粉中的α-糖苷鍵裂解，部 分產物形成CDs)；偶聯(CDs的環狀結構中α-糖苷鍵裂解，將所得的寡糖向轉 移至受體底物)；歧化(直鏈低聚糖的α-糖苷鍵斷鏈，產生的葡萄糖糖基轉移到 受體底物，生成聚合度不同的糖基化產物)和水解(水分子作為受體，催化底物 水解，形成低聚糖)。其中，環化反應產生CDs是CGTase的特征反應，即CGTase 催化淀粉的α-糖苷鍵裂解，部分產物作為糖基受體形成CDs。而偶聯反應和環 化反應互為逆反應。環化、耦合、歧化是轉糖基作用，活性較高，工業生產中主 要是利用CGTase的轉糖基作用；水解作用的活性通常較低，并且控制CGTase 的水解活性將有利于環糊精的生產。

CGTase酶法催化淀粉形成CDs，產物通常是α-、β-、γ-CD的混合物，這對 CDs的后續分離和純化產生不利影響。為了提高CGTase的產物特異性，主要有 兩種有效的策略，向反應體系中添加有機溶劑或者使用定點誘變來改變CGTase 的結構。雖然添加有機溶劑可以提高環糊精的特異性和總收率，但是溶劑(如甲 苯或丙酮)的毒性和從最終產品中除去溶劑的成本極大地限制了環糊精產品的大 規模應用，特別是在食品和醫藥工業中。與使用有機溶劑相比，改變CGTase的 結構的方法更環保且成本更低。因此，合理修飾CGTase以提高產物特異性至關 重要。而β-CD由于自身的水溶性低、提純相對容易，所以目前在實際工業應用 上最為廣泛的是β-CD，占據CDs生產量的主導地位。

目前，凌國慶公開的碩士論文《蠟狀芽孢桿菌β-CGTase發酵、基因克隆表 達及其酶學性質研究》中公開一種高產β-CGTase的菌株，該菌株是利用氮離子 對蠟狀芽孢桿菌進行誘變選育獲得，雖然其得到了了高產β-CGTase的菌株，但 是不確定性較大、成本高。凌凱公開的碩士論文《環糊精糖基轉移酶分子改造， 產物特異性和酶學性質研究》中發現了來源于蠟狀芽孢桿菌的CGTase43位氨基 酸對CGTase產物特異性具有重要作用，其以重組質粒pET22b/cgt為模板，采用 全質粒的突變方法對43位組氨酸進行飽和突變，最終獲得對γ-CD特異性最好 的突變酶，可見，凌凱雖然采用了頂點突變的方法獲得突變酶，但其是針對γ-CD 特異性的適用的，并不適用于工業應用的β-CD(即β環糊精糖基轉移酶)，可見， 目前急需一種能夠直接獲得用于β-CD的生產的工程菌及方法。

發明內容