[發(fā)明專利]一種用于制備R型去氧腎上腺素的酮還原酶突變體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811607675.7
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109456949A
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 竺偉;包蕾
• 申請（專利權）人: 尚科生物醫(yī)藥（上海）有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/53;C12P13/00
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本發(fā)明涉及一種用于制備R型去氧腎上腺素的酮還原酶突變體，屬于蛋白質(zhì)工程技術領域。通過蛋白質(zhì)工程對酮還原酶進行飽和突變，構建出突變體文庫，并對該文庫進行篩選，得到了在催化α?氯代?3?羥基苯乙酮轉(zhuǎn)化為(R)?2?氯?1?(3?羥基苯基)乙醇中間體過程中，手性選擇性提高的酮還原酶突變體，中間體ee值由突變模板酶的98.5％提高至99.8％，可以不需提純直接用于后續(xù)化學反應，直接制備R型去氧腎上腺素，工藝得到了進一步簡化，降低了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程技術領域，具體涉及一種用于制備R型去氧腎上腺素的酮還原酶突變體。

背景技術

去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)，又名苯腎上腺素，是一種α1受體激動藥物，具有血管收縮作用。去氧腎上腺素由于側(cè)鏈存在手性碳原子而存在異構體，分為R型去氧腎上腺素和S型去氧腎上腺素，其中R型異構體的受體激動作用遠強于S型異構體。

在臨床中，廣泛應用于陣發(fā)性室上性心動過速、在休克及麻醉時用于維持血壓、在眼科檢查中可作為安全的短效擴瞳藥使用，作為偽麻黃堿最簡單有效的替代品，R型去氧腎上腺素在非處方感冒藥中的使用也呈現(xiàn)增長趨勢。

R型去氧腎上腺素最初是通過化學法進行手性拆分來制得的，后來隨著合成工藝的改進，開始采用不對稱氫化方法制備R型去氧腎上腺素。

鑒于生物酶具有獨特的催化專一性，反應溫和等優(yōu)點，越來越多的研究學者采用生物法手性拆分R型去氧腎上腺素。

專利US8617854公開報道一種采用酶催化技術改進R型去氧腎上腺素的制備工藝。他們使用固氮弧菌屬物種EBN1的醇脫氫酶催化合成R型去氧腎上腺素的中間體(R)-2-氯-1-(3-羥基苯基)乙醇，底物濃度<50mM(8.5g/L)，ee值未見報道。該路線使用了醇脫氫酶(EC1.1.1.1)作為生物催化劑，且在兩相液體反應介質(zhì)中進行。由于在兩相反應體系中，反應產(chǎn)物與水分離，不利于使反應液直接參與下一步的甲胺化反應，增加了操作成本。

因此，目前急需一種能夠在單相體系中，具有高催化效率、高手性選擇性地還原α-氯代-3-羥基苯乙酮為(R)-2-氯-1-(3-羥基苯基)乙醇的酮還原酶，以此簡化和改進R型去氧腎上腺素的合成工藝，提高原料藥R型去氧腎上腺素的生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，本發(fā)明提供一種用于制備R型去氧腎上腺素的酮還原酶突變體。

一方面，本發(fā)明提供的酮還原酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所編碼的氨基酸序列發(fā)生突變的氨基酸序列，所述發(fā)生突變的氨基酸序列的突變位點為第199位的天冬酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

進一步，所述酮還原酶突變體氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

進一步，酮還原酶表達于基因工程菌，如大腸桿菌或酵母菌。

進一步，所述酮還原酶用于制備R型去氧腎上腺素，見Scheme 1。

更進一步，α-氯代-3-羥基苯乙酮在酮還原酶催化作用下，轉(zhuǎn)化為(R)-2-氯-1-(3-羥基苯基)乙醇，產(chǎn)物ee值可達99.8％。

進一步，基因編碼權利要求1所述的酮還原酶突變體。

進一步，所述的基因核苷酸序列為SEQ ID NO.3。