[發(fā)明專利]在親和層析純化中減少抗體多聚的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811606430.2
• 申請(qǐng)日: 2018-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109678951A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王芳;陳俏梅;王卓智;李競(jìng);陳智勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海藥明生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/00
• 分類號(hào): C07K16/00;C07K1/22
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權(quán)

本發(fā)明公開(kāi)一種在親和層析純化中減少抗體多聚的方法，是以含0.1～1.0M精氨酸的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。本發(fā)明通過(guò)在洗脫液中加入精氨酸可以抑制親和層析時(shí)抗體多聚的產(chǎn)生，且不會(huì)干擾抗體結(jié)構(gòu)并維持單體狀態(tài)，減少樣品的多聚峰，增加樣品的主峰，增加回收率。精氨酸會(huì)抑制多聚來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)，但不會(huì)使蛋白變性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及親和層析純化中減少抗體多聚的方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)，腫瘤治療領(lǐng)域迅速發(fā)展，抗體已成為生物制藥行業(yè)的關(guān)鍵治療手段之一。至今，有超過(guò)100個(gè)雙特異性抗體藥物正在處于研究階段，其中大多數(shù)都處于臨床前和臨床Ⅰ期階段。Protein A/G在抗體的親和純化中得到了廣泛應(yīng)用，Protein A在中性pH下與抗體結(jié)合，這種特異性的結(jié)合不能通過(guò)簡(jiǎn)單的離子強(qiáng)度去洗脫，需要用較低的pH(2.5-3.5)去洗脫。而在較低的pH洗脫條件就會(huì)造成抗體的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致抗體發(fā)生聚集或降解，降低純化效率。

精氨酸是一種兩性氨基酸，化學(xué)式C₆H₁₄N₄O₂，pKa值分別為2.17、9.04和12.48。通常用于蛋白質(zhì)的生物合成。與主鏈最接近的側(cè)鏈部分較長(zhǎng)、有機(jī)且疏水，另一端的側(cè)鏈?zhǔn)且粋€(gè)胍基，在中性或酸性或堿性的環(huán)境下都帶正電，具有高度極性。精氨酸是蛋白質(zhì)再折疊常用的添加劑之一，具有穩(wěn)定蛋白、增加變性蛋白的溶解性、阻止蛋白再折疊等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，提供一種在親和層析純化中減少抗體多聚的方法，能提高純化后樣品的純度。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種在親和層析純化中減少抗體多聚的方法，以含0.1～1.0M精氨酸(Arginine)的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。

具體的，所述精氨酸的濃度可以為0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M，0.9M，或1.0M。

優(yōu)選的，所述精氨酸濃度為0.1～0.5M；更優(yōu)選的，所述精氨酸濃度為0.2～0.4M；最優(yōu)選的，所述精氨酸濃度為0.2M。

具體的，所述洗脫緩沖液含0.05～1.0M甘氨酸(Glycine)、0.1～1.0M精氨酸且pH≥3.5且pH為酸性。其中，甘氨酸濃度可以為0.05M，0.1M，0.15M，0.2M，0.25M，0.3M，0.35M，0.4M，0.45M，0.5M，0.55M，0.6M，0.65M，0.7M，0.75M，0.8M，0.85M，0.9M，0.95M，或1.0M。所述精氨酸的濃度可以為0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M，0.9M，或1.0M。

優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液含0.05～0.5M甘氨酸、0.1～0.5M精氨酸且pH≥3.5且pH為酸性；更優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液含0.1～0.3M甘氨酸、0.2～0.3M精氨酸且pH≥3.5且pH≤4.0；最優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液含0.1M甘氨酸、0.2M精氨酸且pH＝3.5；

具體的，在洗脫之前，先用平衡2緩沖液進(jìn)行層析柱平衡，所述平衡2緩沖液為0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具體的，在平衡2之前，先用沖洗緩沖液進(jìn)行層析柱沖洗，所述沖洗緩沖液為600mM精氨酸溶液，pH 8.0。

具體的，在沖洗之前，先用平衡1緩沖液進(jìn)行層析柱平衡，所述平衡1緩沖液為0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具體的，在洗脫之后，用清潔緩沖液進(jìn)行層析柱清潔，所述清潔緩沖液為100mM磷酸溶液。

具體的，在清潔之后，用平衡3緩沖液進(jìn)行層析柱平衡，所述平衡3緩沖液為0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。