[發明專利]一種酶活提高的青霉素酶突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201811601243.5
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109486802B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 李潤明;羅春;郝宇;丁姝元;邱壯偉;王金剛;陳舒明;粱巖
• 申請（專利權）人: 廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司;上海駿捷生化科技有限公司
• 主分類號: C12N9/86
• 分類號: C12N9/86;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;宋靜娜

本發明涉及一種酶活提高的青霉素酶突變體及其構建方法，屬于基因工程技術領域。本發明酶活提高的青霉素酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發明采用單點突變技術，基于同源建模方法，通過選擇特定氨基酸優化青霉素酶分子結構、提高酶活，對于滿足青霉素酶工業化成產需求和降低生產成本有重要意義。

技術領域

本發明涉及一種酶活提高的青霉素酶突變體及其構建方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

自1929年青霉素發明以來，抗生素在防治細菌性疾病方面，發揮了巨大的作用。但是，由于抗生素的長期大量使用，特別是不規范地濫用抗生素，導致了日益嚴重的細菌耐藥性問題。細菌耐藥最主要的機制是產生滅活酶，如β-內酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶等。β-內酰胺酶能夠與β-內酰胺的羧基共價結合，使其酰胺鍵水解，滅活青霉素和/或頭孢菌素。β-內酰胺酶種類較為復雜，到目前已發現有三百多種，并且由于超廣譜β-內酰胺類抗生素的大量使用，出現了耐受超廣譜β-內酰胺類抗生素的超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)。根據末端氨基酸序列及編碼基因的位點可將β-內酰胺酶分成A、B、C和D四類：SHV屬于A類，金屬酶屬于B類，AmpC酶屬于C類，0XA型酶屬于D類。A型和D型酶屬于青霉素酶；C型酶屬于頭孢菌素酶；B型酶依靠金屬離子而保持活性，因此被稱為金屬酶。

A型β-內酰胺酶的代表酶是TEM型酶和SHV型酶，它們能分解青霉素類藥物，而對頭孢菌素類藥物的水解能力低。A型酶可被克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等酶抑制劑所抑制。

D型β-內酰胺酶的特點是能分解其它幾乎不能被β-內酰胺酶分解的oxacillin等青霉素類藥物，被稱為OXA型酶。此型酶多數分離自綠膿桿菌，其亞型也很多。克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等對此型酶有很強的抑制作用。

超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)作為β-內酰胺類藥物耐藥的主要機制，通過破壞β-內酰胺環使得抗菌藥物的分子抗菌性失活，繼而引發耐藥菌株的產生。ESBLs主要包括以下幾種類型，以SHV型、TEM型、CTX-M型最為常見，其余各型包括PER型、GES型、BES型、VEB型等，各酶型間的流行分布及水解活性存在一定差異。SHV型β-內酰胺酶作為早期發現的代表酶型之一，其耐藥基因大多由質粒介導傳播。自1983年在德國報道了首例SHV型ESBL以來，截至2016年底，全球范圍內已被公布的SHV型變異體已達180多種，且在醫院獲得性或社區感染性微生物中廣泛傳播。

SHV型β-內酰胺酶屬于A類絲氨酸類β-內酰胺酶，是最早發現、且最為流行的酶型之一。1972年，首次在德國的一株大腸埃希菌中發現了SHV-1型β-內酰胺酶，SHV-1源性酶以點突變的方式影響其表達的1-5個氨基酸發生替換，逐漸擴大了酶蛋白的底物譜。1983年，在一株耐頭孢噻肟的臭鼻克雷伯菌中發現了一種SHV型ESBL，命名為SHV-2，此為第一個發現的SHV型超廣譜β-內酰胺酶。研究發現，與SHV-1相比，SHV-2僅在第238位發生了Gly238Ser氨基酸突變，而這種單一氨基酸的取代改變了SHV-1型酶的活性，耐藥譜上則拓寬了對第三代頭孢類藥物的水解活性。此后，SHV型ESBLs變異體逐漸出現，如SHV-2a型、SHV-3型、SHV-4型、SHV-5型、SHV-12型等。

GMP中規定無菌藥品(包括生物制品)的無菌生產工藝必須采用環境監測來評估生產環境控制是否達到GMP要求。監控項目包括空氣懸浮粒子、空氣浮游菌、沉降菌、設施和設備表面的微生物以及操作人員的衛生狀況監測等。注射用青霉素類抗生素無菌分裝間、功能間屬于產塵功能間。青霉素類抗生素粉塵落入監測用培養基平皿中，將降低平皿中培養基靈敏度，進而影響生產過程環境監控數據準確可靠性。監測用培養基平皿中添加青霉素酶的量，以確保環境監測用監測皿培養基靈敏度適用于生產過程環境監控。開發高活性的青霉素酶具有較高的商業價值。

異源表達青霉素酶突出的問題是，蛋白表達量低、青霉素酶活低。因此，定點突變改造青霉素酶，提高胞外酶活，對于滿足青霉素酶工業化成產需求和降低生產成本有重要意義。本發明采用單點突變技術，基于同源建模方法，通過選擇特定氨基酸優化青霉素酶分子結構、提高酶活。