[發明專利]一種用于刺激細胞大量分泌外泌體的方法

有效

• 申請號: 201811600979.0
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN111363679B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 王書崎;吳建國;吳迪;梁利國;武國華
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12M1/42;C12M1/02;C12N5/0781;C12N5/0786
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 何碧珩

本發明公開了一種用于刺激細胞大量分泌外泌體的方法，采用脈沖攪拌式生物反應器培養細胞，包括以下步驟：打開生物反應器開關，開啟培養液加注口閥門，加注培養基，灌滿細胞培養腔；控制接種口閥門開啟，接種細胞；打開磁力攪拌及脈沖裝置，模擬體內細胞生長環境，刺激細胞分泌外泌體；監測芯片實時監測細胞培養環境，并通過主機調節培養條件；細胞在培養裝置中生長2天后，開啟過濾泵，使培養液通過分離收集裝置，收集終產物外泌體。該生物反應器可以使培養液和細胞充分混合以保持足夠供氧，而且攪拌裝置不直接接觸細胞，減小細胞所受剪切力，同時，本發明方法模擬體內細胞生長環境，刺激NK細胞大量分泌外泌體。

技術領域

本發明涉及外泌體的制備和分離技術，具體涉及一種用于刺激細胞大量分泌外泌體的方法。

背景技術

外泌體(exosomes)是一種具有脂質雙分子層，直徑約30-150nm的細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)。外泌體內可包含蛋白質、脂質、核酸類等多種生物活性物質，人體大部分細胞如免疫細胞(T細胞、B細胞、Kupffer細胞和NK細胞)、內皮細胞、血小板等均能分泌外泌體。目前，外泌體在臨床治療上的研究可以大致歸納為：(1)調節外泌體的釋放及分布。(2)基于外泌體的藥物傳遞。(3)外泌體介導的腫瘤靶向治療。(4)外泌體與免疫治療。目前，外泌體在結核病的免疫治療，在骨腫瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌等多種癌癥的診斷、抑制或調控腫瘤細胞轉移、預后監測和治療中均表現出巨大的應用前景。另外，細胞外泌體作為細胞與細胞間相互交流的一種載體，同時也是干細胞旁分泌活動的重要方式，在組織再生中發揮著重要作用，近年來的研究表明，MSCs外泌體具有類似MSCs的功能，包括修復與再生組織、抑制炎癥反應及調節機體免疫。

CAR-T細胞療法(CAR-T therapy)是利用經過基因改造的T細胞殺死癌細胞，該方法已經被證實是當其他治療方法都失敗時的一種有前途的選擇。而在一項新的研究中，來自美國加州大學圣地亞哥分校和明尼蘇達大學的研究人員報道利用人誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPS細胞)培養出的并且以與CAR-T細胞相似的方式加以修飾的自然殺傷細胞(natural killer cell,NK細胞)在小鼠模型中高效地抵抗卵巢癌。而有報道稱NK細胞外泌體具有NK細胞部分的功能，且更小，特異性更好，有望在細胞治療方面發揮獨特作用。

近年來，有研究表明NK細胞可以分泌具有NK細胞標記物和殺傷蛋白的外泌體，對腫瘤細胞造成殺傷作用，此外，由于外泌體具備向定向靶器官轉移的特性，可將其設計成為精準給藥的藥物載體，將特定藥物運輸到靶器官發揮作用。因此，NK細胞的外泌體在腫瘤治療及藥物靶向載體的應用研究中具有很大潛力。目前對于外泌體的提取和純化主要依據外泌體的理化特性進行，常見采用差速離心聯合蔗糖密度梯度離心法、超濾法、免疫磁珠提取法和ExoQuick Precipitation提取法等方法。

目前，生物反應器是細胞大規模懸浮培養的核心設備，能夠有效的增加細胞單位體積的培養密度。動物細胞培養生物反應器根據其內部是否有攪拌槳，分為攪拌式細胞培養生物反應器和非攪拌式細胞培養生物反應器。攪拌式細胞培養反應器通過攪拌槳旋轉產生渦流，完成對培養液的曝氣供氧，但這種方式產生的機械剪切力較大，極易損傷細胞。目前，只能通過控制攪拌轉速來減輕對細胞的影響，但問題依然存在。而非攪拌式細胞培養反應器產生的剪切力小，主要采用震動、搖動、滾動或擺動等方式使培養液運動，保持細胞的懸浮狀態及培養液的氣體交換。其缺點是難以保證氧氣的吸收效率。近年來也有采用空氣或氧氣噴射解決培養液中氧氣供給的方法，但這種方法易產生大量泡沫，泡沫破裂過程中也會對細胞造成物理損傷，過量的氧氣噴射也會使細胞受毒害。對氣體噴射的精密控制也使反應器設備復雜化，增加了細胞培養的成本。因此，如何提供均勻的攪拌，使培養液和細胞充分混合以保持足夠的供氧，同時減少對細胞的機械剪切損傷是一個急需解決的問題。

發明內容

為了解決上述存在的問題，本發明提供了一種用于刺激細胞大量分泌外泌體的方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：