[發明專利]一種鴨瘟病毒UL41基因無痕缺失株DPV CHv-ΔUL41及其構建方法

有效

• 申請號: 201811600145.X
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109609550B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 汪銘書;何天瓊;程安春
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/38;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 郭艷艷;傅曉

1.一種鴨瘟病毒UL41基因無痕缺失株DPV CHv-ΔUL41的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將pBAC-DPV質粒轉化到GS1783大腸桿菌感受態中，獲得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制備GS1783-pBAC-DPV感受態；

(2)以pEPKan-S為模板，GS1783-BAC-ΔUL41-F和GS1783-BAC-ΔUL41-R為引物，通過PCR方法擴增包含I_SceI酶切位點和Kana元件的堿基片段以及UL41基因上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-UL41，切膠回收獲得I_SceI-Kana-UL41片段；

(3)將I_SceI-Kana-UL41片段轉化到GS1783-pBAC-DPV感受態中，篩選，獲得陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-UL41-Kana；

(4)將陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-UL41-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，制備GS1783-pBAC-DPV-ΔUL41感受態；

(5)以pEPKan-S為模板，以GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R作為引物，通過PCR方法擴增包含I_SceI酶切位點和Kana元件的堿基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp處和位于MiniF元件ori2基因下游290bp處的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切膠回收獲得I_SceI-Kana-MiniF片段；

(6)以CHv基因組為模板，CHv-UL23-F和CHv-UL23-R為引物，通過PCR方法擴增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重疊25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp處的同源臂片段，切膠回收獲得UL23-MiniF片段；

(7)以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段為模板，進行PCR融合反應，然后以融合片段為模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作為引物進行PCR擴增獲得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；

(8)將I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段轉化到GS1783-pBAC-DPV-ΔUL41I感受態中，經抗生素篩選和PCR鑒定，獲得陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUL41-UL23-Kana；

(9)將陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUL41-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，獲得陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUL41-UL23；

(10)從陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUL41-UL23中提取pBAC-DPV-ΔUL41-UL23質粒，將pBAC-DPV-ΔUL41-UL23質粒轉染DEF細胞，通過克隆篩選，獲得的UL41基因無痕缺失株DPV CHv-ΔUL41。

2.根據權利要求1所述的鴨瘟病毒UL41基因無痕缺失株DPV CHv-ΔUL41的構建方法，其特征在于，步驟(2)、步驟(5)和步驟(6)中所述PCR擴增體系為：ddH₂O 22μL、Max DNA Polymerase 25μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；

PCR擴增條件為：98℃預變性2min、98℃變性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30個循環，最后72℃延伸10min。

3.根據權利要求1所述的鴨瘟病毒UL41基因無痕缺失株DPV CHv-ΔUL41的構建方法，其特征在于，步驟(2)中引物序列為：

GS1783-BAC-ΔUL41-F:5’-ATTACGGGACAACAGCGCCGAAACGTAAGACGACAATACAtagggataacagggtaatcgattt-3’；

GS1783-BAC-ΔUL41-R:5’-CTATTAATAGTTTAAATAAAAACTCTTACAACAGTTAATCTGTATTGTCGTCTTACGTTTCGGCGCTGTTGTCCCGTAATgccagtgttacaaccaat-3’。