[發明專利]農桿菌介導水稻遺傳轉化篩選培養基及其應用

在審

• 申請號: 201811599245.5
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109504706A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 米鐵柱;張國棟;劉佳音;王晶;唐新穎;李儒劍;孫艷君
• 申請（專利權）人: 青島袁策集團有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 李冰

本申請公開了一種農桿菌介導水稻遺傳轉化篩選培養基，包括基礎培養基和篩選抗生素，所述基礎培養基原料進一步包括：N6大量元素、MS微量元素、B5有機元素、鐵鹽、肌醇、脯氨酸、水解酪蛋白、谷氨酰胺、蔗糖、植物凝膠、2，4?D、6?BA、蒸餾水；所述篩選抗生素包括下列組份的一種或多種：潮霉素、特美汀、氧氟沙星。本發明通過選擇各個基礎培養基原料，探索篩選抗生素的類型和濃度、抑菌抗生素的類型和濃度，研制出一種農桿菌介導水稻遺傳轉化所用的篩選培養基。

技術領域

本發明涉及分子生物學轉基因水稻遺傳育種技術領域，特別涉及一種外源基因轉化水稻時所用篩選培養基及其應用。

背景技術

轉基因技術就是將外源基因通過生物、物理或化學手段導入其他生物基因組，以獲得外源基因穩定遺傳和表達的遺傳改良體。

水稻轉基因技術始于原生質體培養，1985年首次成功地從水稻原生質體再生完整植株；1988年在粳稻品種中獲得第一批轉基因水稻植株；1990年從秈稻品種ChinsurahBoro II中獲得第一例轉基因秈稻植株；1990年李寶健等用農桿菌感染水稻組織獲得轉化愈傷組織；1991年利用水稻幼胚作為受體材料，用基因槍法，成功獲得轉基因植株，并且轉化效率明顯提高。從此，幼胚作為轉基因受體材料得到廣泛研究應用。

1993年用農桿菌法在粳稻品種上獲得了轉基因植株，此后，基因槍轟擊法和農桿菌介導法作為最有價值的轉化途徑廣泛用于水稻轉基因研究。

基因槍法是20世紀80年代末逐步發展起來的，其原理是將外源DNA包在微小的金粒或鎢粒表面，再通過高壓將微粒高速地射入受體細胞或組織。微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上得以表達，從而實現基因的轉化。

自1989年首先用基因槍轉化玉米獲得轉基因植株以來，在水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥等重要禾谷類作物中相繼成功。基因槍法是基因直接轉化的方法之一，具有操作簡便，受體材料廣泛等優點，但成本較高，轉化頻率較低。

農桿菌介導法是將外源基因插入農桿菌的質粒上，由載體將外源基因轉移并整合到植物細胞基因組中去。基本程序包括：受體系統的建立、轉化載體的構建和目的基因的轉化三個方面。

利用土壤農桿菌轉化水稻，轉基因水稻植株的再生頻率可高達10％～30％。該轉化系統利用天然的轉化載體系統，成功率高，遺傳穩定性好，可以連接不同的啟動子，使外源基因在不同組織里特意表達，且載體可容納大片段的異源DNA，所以該方法是目前最常用的轉基因方法。

PEG轉化法是禾谷類作物轉化方法中最早應用的方法之一，其主要原理是利用化合物聚乙二醇(PEG)及高pH條件誘導原生質體體外攝取外源DNA。原生質體作為受體具有群體數大，便于操作，DNA分子易進入，獲得純合性的轉化子等優點，但原生質體培養難度大、再生頻率低、周期長、不適合水稻轉化研究。

電擊法也是以原生質體為受體的轉化方法。其原理是利用短暫的電場脈沖作用，使原生質體膜形成可逆的瞬間通道，使DNA進入細胞。其轉化效率高于PEG法，但目前很少應用。

花粉管通道法，其基本原理是利用植物授粉后一段時間內，從珠孔到珠心之間有一條花粉管通道，外源基因可通過此管道進入到胚囊并轉化尚不具備正常壁的卵、合子或早期胚胎細胞，進而借助于天然的種胚系統形成轉基因種胚。該方法簡單、快速、易被人接受，但機理尚不完全清楚，目前應用并不是很多。

在植物基因工程研究中，快速、有效地從大量轉化群體(包括愈傷組織和種子等)篩選到含有外源目的基因的轉化體是成功獲得轉基因植株的關鍵。單子葉植物的遺傳轉化在育種上具有廣闊的應用前景。

目前在高等植物中應用的篩選標記有抗生素類、除草劑類、氨基酸類等等。為獲得穩定遺傳轉化的水稻，需選用水稻較為敏感的篩選標記，來抑制未轉化細胞的生長，使攜帶有篩選標記基因的轉化細胞在生長競爭中處于優勢，以獲得所需要的轉化植株。

發明內容