[發明專利]一種黑腹果蠅腫瘤模型及其應用

有效

• 申請號: 201811599102.4
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109601487B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 于振洋;沈佳穎;尹大強;史嘉琳;胡子欣;邱彬洋
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 盛君梅

1.一種黑腹果蠅腫瘤模型在研究環境污染物單世代及多世代致癌毒性方面的應用，其特征在于具體步驟如下：

(1)黑腹果蠅腫瘤模型品系單世代在含有污染物的培養基體系內暴露后雜交，觀察其雜交后代幼蟲在污染物作用下腫瘤遷移率的變化，指示和評價污染物單世代暴露的生物致癌毒性效應；

(2)連續暴露條件下，將果蠅腫瘤模型親本品系各自在含有污染物的培養基體系內暴露，將其子代也同樣連續暴露在相同的暴露體系下；多世代連續暴露后的黑腹果蠅腫瘤模型在污染物環境中雜交，進行同步驟(1)的觀察操作，指示和評價污染物多世代暴露的生物致癌毒性效應；

(3)固定黑腹果蠅腫瘤模型中一種品系的雌蠅進行單世代和多世代暴露于含有污染物的培養基體系中，另一品系的雄蠅在無污染物培養基中完成單世代及多世代的培養；將同一代的兩品系果蠅在無污染物培養基內雜交，對雜交后代進行同步驟(1)的觀察；

而后交換兩品系的培養環境，即交換含有污染物的培養基與無污染物培養基，進行同樣的后續操作；通過比較不同性別生物暴露于污染物后得到的致癌指標變化，指示和評價污染物對不同性別生物的單世代和多世代致癌毒性效應；

所述黑腹果蠅腫瘤模型包含兩類品系，分別為：yw，ey-Flp；tub-Gal80，FRT40A；Act＞y⁺＞Gal4，UAS-GFP(185)和w；lgl⁴FRT40A UAS-Ras^v12/Cyo；Sb/TM6B Tb(186)，分別將其編號為185和186；

將185與186分別培養于含有污染物的培養基體系內以及無污染物培育基內；第一代投入含有污染物的培養基體系中或者無污染物培育基內暴露的185和186各自的親本果蠅記為F0代。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于步驟所述185和186均來自BloomingtonDrosophila Stock Centre USA實驗室。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述含有污染物的培養基體系是指污染物梯度濃度組，其配制方法為：

首先配制無污染物培養基，其包含紅糖、玉米粉、酵母、瓊脂和丙酸；然后在無污染物培養基配制完成但尚未凝固前，在每100g無污染物培養基中加入2mL暴露液，分裝至10個玻璃管；而后冷卻凝固于滅菌后的玻璃管內，加塞備用；

在觀察時需同時觀察空白對照組的培育情況，所述空白對照組的配制方法為：在無污染物培養基配制完成但尚未凝固前，在每100g無污染物培養基中加入2mL加入純水或污染物稀釋液。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于步驟(1)的操作方法為：

用CO₂氣體使果蠅被麻醉，而后轉移至持續通CO₂的果蠅麻醉盒上；分別挑選185的F0代處女蠅和186的F0代雄蠅各五只為一組，將其轉移至同一個含有污染物的培養基中，在其表面灑少許活酵母，放置于25℃恒溫，60％恒濕的培養箱內，每隔24h轉管一次，使兩品系果蠅在24h內進行雜交，保證每個污染物濃度有10個以上平行組，F0代185和F0代186成蟲雜交后產下的后代幼蟲記為T0代，其中攜帶腫瘤的個體僅能生長至幼蟲，無法進一步發育；

在25℃下培養3-4天，待T0代長至三齡幼蟲后，用鑷子挑取污染物暴露后的或對照組的三齡幼蟲放置于添加了PBS的解剖墨盤上，剝離幼蟲眼部、腦部和腦腹神經索VNC；若形成了腫瘤組織，則組織分化不明顯，將整團腫瘤組織單獨剝離即可；

在熒光顯微鏡GFP下，觀察腫瘤組織發生綠色熒光的位置與強度，進行實時拍攝；在熒光顯微鏡下進一步將VNC與其他組織分離，單獨拍攝；腫瘤遷移率作為致癌毒性的評價指標，以VNC組織中出現綠色熒光標記為遷移標志，統計發生遷移的個數，遷移率計算公式為：