[發(fā)明專利]采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811599011.0
• 申請(qǐng)日: 2018-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN109680042A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮延葉;賴煦卉;孫大鵬;趙騫;吳知才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢愛博泰克生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務(wù)所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

1.一種采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化方法，其步驟如下：

1)消化過程：

對(duì)DNA文庫中的DNA分子，利用外切酶從DNA分子末端消除堿基，暴露出黏性末端；

2)捕獲過程：

2.1)磁珠和步驟1)獲得的具有黏性末端的DNA分子結(jié)合，其中磁珠為已知用量的帶有DNA結(jié)合片段的磁珠，所述DNA結(jié)合片段與DNA分子黏性末端特異性結(jié)合；

2.2)利用DNA聚合酶補(bǔ)齊黏性末端上可能存在的缺口或者切掉Flap DNA結(jié)構(gòu)，再用DNA連接酶將缺刻連接起來；

3)漂洗過程：

將已捕獲DNA分子的磁珠吸附在磁力架上，使用磁珠漂洗緩沖液洗掉未結(jié)合的DNA分子；

4)混樣：

針對(duì)多個(gè)不同樣本DNA文庫，通過的重復(fù)步驟1)～3)以獲得已捕獲不同DNA分子的多種磁珠，并按照相同或相似的量將多種磁珠混合在一起；

5)洗脫：

使用DNA洗脫液和內(nèi)切酶從步驟4)獲得的混合的多種磁珠上洗脫DNA分子，得到可上機(jī)測(cè)序的文庫樣本。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化方法，其特征在于：所述磁珠為鏈霉素親和磁珠，它通過生物素與DNA結(jié)合片段相連。

3.一種采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，它的應(yīng)用對(duì)象為具有黏性末端的DNA分子，包括如下組分：

(1)用于結(jié)合生物素修飾的DNA分子的鏈霉素親和磁珠；

所述鏈霉素親和磁珠通過生物素修飾分子結(jié)合有DNA結(jié)合片段，所述DNA結(jié)合片段包括特殊修飾堿基、DNAlinker、用于結(jié)合目標(biāo)DNA分子的特異性DNA序列；

所述特殊修飾堿基為用于在特殊條件下釋放目標(biāo)DNA的堿基；

所述DNAlinker的長(zhǎng)度為1～100bp；

所述特異性DNA序列的長(zhǎng)度為長(zhǎng)度3～200bp；

(2)工具酶

所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA內(nèi)切酶；

(3)工具酶反應(yīng)體系

各個(gè)工具酶對(duì)應(yīng)的反應(yīng)所需要的緩沖液；

(4)磁珠漂洗緩沖液

所述磁珠漂洗緩沖液用于漂洗磁珠，洗掉未結(jié)合的DNA分子；

(5)DNA洗脫液

所述DNA洗脫液用于從磁珠上洗脫目標(biāo)DNA分子。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，其特征在于：

所述DNA結(jié)合片段從5’到3’依次為DNAlinker、特殊修飾堿基、特異性DNA序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，其特征在于：所述外切酶，選自Exo I,Exo III,Exo T5,lambda Exo，ExoT7；

所述DNA聚合酶，選自Taq聚合酶、B家族DNA聚合酶；

所述DNA連接酶，選自T4DNA連接酶、T7DNA連接酶、TaqDNA連接酶、E.coli DNA連接酶；

所述DNA內(nèi)切酶，選自UDG、EndoVIII、EndoIV、Fpg。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，其特征在于：所述特殊修飾堿基還包括用于防止鏈延伸的堿基和/或防止目標(biāo)DNA文庫的3’端OH延伸的堿基。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述采用磁珠混樣處理DNA的測(cè)序文庫標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，其特征在于：所述特殊修飾堿基為dUTP、8-oxo-dGTP、dITP、AP位點(diǎn)、RNA堿基。