[發(fā)明專利]烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法

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• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109540861A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚明乾;李加齊;曹林;宋勛禹;鐵珊珊;叢爽;張雪迪;李昱
• 申請（專利權(quán)）人: 大連工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/31
• 代理公司: 大連科技專利代理有限責(zé)任公司 21119
• 代理人: 郭日志

1.一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、將熒光碳點(diǎn)溶在超純水中，使用熒光光譜儀掃描熒光碳點(diǎn)的3D熒光波譜，以確定熒光碳點(diǎn)的最大激發(fā)和發(fā)射波長，同時(shí)得到碳點(diǎn)的熒光峰型，使用透射電子顯微鏡觀察熒光碳點(diǎn)的粒徑分布；

B、胃蛋白酶酶活的測定是以血紅蛋白為底物，以酪氨酸作對照，確定胃蛋白酶的活力單位，胰蛋白酶酶活的測定是以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯為底物，以不加熒光碳點(diǎn)為空白，確定胰蛋白酶的活力單位；

C、將NRK細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待NRK細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)進(jìn)行消化，消化后的NRK細(xì)胞懸液進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h，得到貼壁生長的NRK細(xì)胞；

D、將烤鲅魚肉中熒光碳點(diǎn)分散在細(xì)胞培養(yǎng)基中，漩渦震蕩，得到熒光碳點(diǎn)溶液；

E、將步驟D中的熒光碳點(diǎn)溶液梯度稀釋成若干濃度，分別加入到步驟C得到的貼壁生長的NRK細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h；

F、將培養(yǎng)后的NRK細(xì)胞在四氮唑藍(lán)溶液中繼續(xù)培養(yǎng)，向四氮唑藍(lán)溶液培養(yǎng)后的NRK細(xì)胞中加入二甲基亞砜，在波長下測定吸光值，作為實(shí)驗(yàn)組結(jié)果，設(shè)置對照組，對照組的結(jié)果為將NRK細(xì)胞依次經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基、四氮唑藍(lán)溶液和二甲基亞砜溶液處理后測得的吸光度值，將實(shí)驗(yàn)組結(jié)果和實(shí)驗(yàn)對照組結(jié)果代入公式計(jì)算得到細(xì)胞存活率；

G、用步驟F中得到的潛在危險(xiǎn)濃度的烤鲅魚肉熒光碳點(diǎn)溶液處理步驟C中消化后的對數(shù)期NRK細(xì)胞24 h，經(jīng)胰酶消化后形成單細(xì)胞懸液，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后離心，加入流式細(xì)胞緩沖液，測定細(xì)胞的生存情況，設(shè)置對照組，對照組的結(jié)果為將NRK細(xì)胞依次經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液和流式細(xì)胞緩沖溶液處理后測得的細(xì)胞生存情況，將實(shí)驗(yàn)組結(jié)果和實(shí)驗(yàn)對照組結(jié)果代入公式計(jì)算得到細(xì)胞凋亡率；

H、將實(shí)驗(yàn)鼠分為兩組，對照組和實(shí)驗(yàn)組，將烤鲅魚肉熒光碳點(diǎn)分散在超純水中，漩渦震蕩，得到熒光納米粒子溶液，小鼠口服的暴露，實(shí)驗(yàn)組小鼠口服熒光納米粒子溶液，對照組小鼠口服NaCl水溶液，分別取對照組和實(shí)驗(yàn)組口服不同時(shí)間的小鼠主要器官觀察熒光納米粒子在小鼠器官中的積累情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于：所述步驟A中將熒光碳點(diǎn)溶在超純水中，濃度為0.1-2 mg/mL，使用熒光光譜儀在Ex=300-450nm，Em=310-600 nm范圍內(nèi)掃描熒光碳點(diǎn)的3D熒光波譜。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于：所述步驟E中熒光碳點(diǎn)的濃度梯度為0-10 mg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于：所述步驟F中在492 nm波長下測定吸光值，作為實(shí)驗(yàn)組結(jié)果，熒光碳點(diǎn)的濃度為0-20 mg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于：所述步驟H中將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡下，分別在405 nm、458 nm和488 nm波段下激發(fā)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于：所述步驟I中試驗(yàn)采用的是4-5周齡雄性小鼠，熒光納米粒子的濃度為0-2 g kg^-1×小鼠體重（kg）/ 400 μL，分別取對照組和實(shí)驗(yàn)組口服0-24h的小鼠主要器官觀察烤鲅魚肉熒光碳點(diǎn)在小鼠器官中的積累情況。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤鲅魚過程中形成的熒光碳點(diǎn)的安全性評價(jià)方法，其特征在于：所述步驟I中小鼠主要器官包括肝、腦、腎、心和腸道，所述熒光碳點(diǎn)的濃度梯度為0-10 mg/mL。