[發明專利]一種亮氨酸-5-羥化酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201811596777.3
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109576234B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 秦慧民;路福平;孫登岳;李玉;毛淑紅
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及一種活性提高的亮氨酸?5?羥化酶突變體及其應用。本發明通過分子生物學手段獲得念珠藻(Nostoc punctiforme)NIES?2108來源的亮氨酸?5?羥化酶編碼基因，采用反向PCR進行定點突變獲得編碼突變體的基因，而后將編碼突變體的基因進行異源表達獲得亮氨酸?5?羥化酶的突變體V77A。該突變體以亮氨酸和蛋氨酸為底物時，其相對酶活性較野生型分別提高了69.53％、23.26％。本發明篩選出的活性提高的變異體，可以更高效地使亮氨酸遠端的5號碳位實現羥基化，并且可催化蛋氨酸生成蛋氨酸亞砜，為工業上藥物中間體的酶法催化生產提供廣闊的前景。

技術領域：

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及一種活性提高的亮氨酸-5-羥化酶突變體及其應用。

背景技術：

羥基化氨基酸由于能在多種化學材料、醫學藥物合成中作為手性前體、中間體和終產物，因此，廣泛應用于多功能生物大分子、醫藥和精細化學品的合成。羥基氨基酸除了可作為醫藥領域藥物合成的中間體，還廣泛用于飼料添加劑、食品強化劑、香料等多個領域，如L-β-羥基丙氨酸除用于食品領域中的氨基酸減肥飲料及運動飲料外，還可作為動物飼料添加劑；L-羥基脯氨酸在果汁、營養飲料、清涼飲料中常作為營養強化劑、增味劑；L-β-羥基丁氨酸也是一種添加劑，常用于食品和飼料領域，另外，5-羥基-亮氨酸是4-甲基脯氨酸重要合成前體，在抗生素淺灰霉素的合成中至關重要。

目前，羥基化亮氨酸的合成方法主要有化學合成和酶法生物合成。微生物轉化是通過微生物體內的相關酶體系的催化而生成目的產物。實現氨基酸遠端碳位的羥基化，化學工藝存在許多弊端，包括工藝路線復雜、反應條件苛刻、副產物多、收率低等等。而酶法催化則因其特異性強、反應條件溫和，產率高等重要優勢，已為許多藥物中間體的開發提供更加高效的策略。

念珠藻(Nostoc punctiforme)NIES-2108來源的亮氨酸-5-羥化酶(LEH，Genbank序列號RCJ32143.1),或稱亮氨酸-5-雙加氧酶，作用是使亮氨酸5號碳位氧化脫氫形成羥基，是實現亮氨酸遠端C-H功能化的關鍵酶，并且能使蛋氨酸發生磺化反應，生成蛋氨酸亞砜。其含有795bp的開放閱讀框，編碼265個氨基酸。

本發明將野生型亮氨酸-5-羥化酶基因LEH化轉到E.coli BL21(DE3)異源表達，上清經過Ni親和層析和離子交換層析純化后，進行酶學性質分析，結果表明其對亮氨酸反應最適溫度為30℃，最適pH為7.4，比酶活為1041.67U/mg，對蛋氨酸反應最適溫度為30℃，最適pH為7.4，比酶活為822.92U/mg，這與工業應用仍存在差距，因此通過對野生型分子改造使其酶活性提高，將有助于亮氨酸-5-羥化酶在工業生產藥物中間體的推廣。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明將提供一種亮氨酸-5-羥化酶突變體及其制備與應用。

實現本發明的技術路線概述如下：

通過分子生物學手段獲得念珠藻(Nostoc punctiforme)NIES-2108來源的亮氨酸-5-羥化酶(以下簡稱野生型，WT)的編碼基因，采用反向PCR進行定點突變獲得編碼突變體的基因，而后將編碼突變體的基因進行異源表達獲得亮氨酸-5-羥化酶的突變體V77A。

在本發明中采用如下定義：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。

2.亮氨酸-5-羥化酶突變體的標識

采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示亮氨酸-5-羥化酶突變體中突變的氨基酸。如Val77Ala，表示位置77的氨基酸由野生型亮氨酸-5-羥化酶的Val替換成Ala，位置的編號對應于SEQ ID No.1中野生型亮氨酸-5-羥化酶的氨基酸序列編號。