[發明專利]一種單細胞基因組目標區域捕獲的方法

有效

• 申請號: 201811596459.7
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109957615B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 洪燕;惠峰;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權）人: 北京安諾優達醫學檢驗實驗室有限公司;安諾優達基因科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種單細胞基因組目標區域捕獲的方法。具體的通過對單細胞基因組進行全基因組擴增，對擴增后的基因組進行打斷、末端修復、3'端加A、加接頭、PCR擴增、目標區域捕獲、對目標區域捕獲的DNA片段進行PCR擴增及測序。通過本發明提供的方法可以提高捕獲測序結果的覆蓋度，提高捕獲結果的特異性。

技術領域

本發明涉及一種單細胞基因組目標區域捕獲的方法，屬于基因檢測技術領域。

背景技術

單細胞測序在2011年被《Nature?Methods》列為年度值得期待的技術之一，在2013年被《Science》列為年度最值得關注的六大領域榜首，其越來越受到科研工作者的青睞，相關的研究成果也井噴式地發表在各頂級期刊上，這些都表明，單細胞測序已逐漸成為科研熱點。

單細胞測序技術可以剖析細胞的異質性，揭示腫瘤細胞基因組中發生的變異。有助于我們描述腫瘤細胞的克隆結構，并追蹤疾病的進展和擴散范圍。目前該技術已廣泛地應用在輔助生殖、癌癥、神經學和免疫學等領域。

單細胞目標區域捕獲測序是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組之后定制目標基因組區域的探針，與基因組DNA進行雜交，將目標區域DNA富集后進行高通量測序的技術手段。單細胞目標區域測序技術用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系，也有助于發現和驗證疾病特別是癌癥的相關候選基因或相關位點，在臨床診斷和藥物開發方面有著巨大的應用潛力[1]。目標區域捕獲測序的優勢在于只對感興趣的基因組區域進行研究，而且在獲得相同數據量時測序深度更深，結果更準確；而且與常規基因組測序相比，其不僅費用較低，數據闡釋也更為簡單。

單細胞基因組目標區域捕獲測序相較于正常樣本(無需擴增基因組，基因組的量足夠進行目標區域捕獲測序的樣本)基因組的目標區域捕獲測序的效果還是有明顯區別的。首先，單細胞基因組只有兩個拷貝，總量約6pg。在擴增過程中，可能無法重現完整的基因組。其次，假如丟失的部分恰是芯片探針的區域，那么就會影響捕獲特異性，造成數據量浪費。而且在相同測序深度下，單細胞目標區域捕獲測序的靶區域覆蓋度較普通基因組的要低。

參考文獻

[1]Wang,Y.et?al.Clonal?evolution?in?breast?cancer?revealed?by?singlenucleus?genome?sequencing.Nature?512,155–160(2014).

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種單細胞基因組目標區域捕獲的方法，通過優化全基因組擴增流程、文庫構建流程以及目標區域捕獲流程，從而提高捕獲測序結果的覆蓋度和捕獲結果的特異性。

1.一種單細胞基因組目標區域捕獲的方法，包括：

步驟A：采用多重置換擴增方法對單細胞基因組進行等溫擴增，獲得擴增后的基因組；

步驟B：取3μg擴增后的基因組進行打斷，獲得片段化的DNA片段；

步驟C：將片段化的DNA片段進行末端修復，獲得平末端DNA片段；

步驟D：將平末端DNA片段進行3'端加A，獲得3'端加A的DNA片段；

步驟E：將3'端加A的DNA片段進行加接頭，獲得加接頭的DNA片段；

步驟F：將加接頭的DNA片段進行PCR擴增，獲得擴增的DNA片段；

步驟G：將擴增的DNA片段進行目標區域捕獲，獲得捕獲的DNA片段；

步驟H：將捕獲的DNA片段進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；

步驟I：將PCR擴增產物進行測序；

其中，所述步驟A中等溫擴增的條件為30℃反應2小時；