[發明專利]用于分離單細胞的含酶組合物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811595506.6
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109628434A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 吳文銘;彭俊雅;陳澔;黃丹;劉路路;洪夏飛;叢林;李冬晶;趙玉沛
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N9/22;C12N5/071;C12N5/09
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 劉依云;王崇

本發明涉及酶工程領域，公開了用于分離單細胞的含酶組合物及其制備方法和應用。所述組合物含有VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶的酶活力單位之間的比值為50?90:0.5?1:2000?5000:1。本發明公開的制備用于分離單細胞的含酶組合物的方法包括：混合VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶。本發明還公開了如上所述的組合物在從胰腺樣品中分離單細胞中的應用。本發明能夠實現單細胞的高收率和高活率提取，特別是胰腺組織，攻克了現有胰腺組織單細胞收率和活率較低的難題。

技術領域

本發明涉及酶工程領域，具體涉及用于分離單細胞的含酶組合物及其制備方法和應用。

背景技術

胰腺是人體中兼具內分泌和外分泌功能的器官。組織學上包含胰島細胞、腺泡細胞、導管細胞以及間質細胞等多個細胞組分。胰腺產生分泌的胰液中含有胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等多種消化酶。隨著近年來單細胞分析技術的興起，人們對與人體組織器官的研究從不同成分混合，互相干擾的整體組織分析逐漸深入到對構成組織器官的單個細胞的研究，其重要性不言而喻。而在胰腺研究領域，由于胰腺器官大體上柔軟而脆弱、組織學上成分復雜且因為強效的胰酶而容易發生自身消化，使得胰腺單細胞研究往往止步于第一步——也即可供分析的胰腺組織單細胞的獲取。

人體或動物模型組織器官單細胞分離方法，從最初的毛細管吸取，到流式分選再到微流體技術，眾多的單細胞分離技術在不同的組織當中或多或少都取得了較為滿意的結果，但在胰腺組織上則差強人意。通過查閱文獻可知，目前研究人員在分離小鼠胰腺癌單細胞時，大多采用以II型膠原酶為主的酶消化解離方法，但是，胰腺單細胞研究者均表示在胰腺單細胞分離時遇到了極大的挑戰，要么單細胞收率不高，要么細胞活率較低，因此，開發能夠有效分離的胰腺單細胞的制劑或方法具有極為重要的意義。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術存在的單細胞收率和細胞活率較低的問題，提供用于分離單細胞的含酶組合物及其制備方法和應用。

為了實現上述目的，本發明一方面提供了一種用于分離單細胞的含酶組合物，該含酶組合物含有VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶的酶活力單位之間的比值為50-90:0.5-1:2000-5000:1。

本發明第二方面提供了一種制備用于分離單細胞的含酶組合物的方法，該方法包括：混合VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶的酶活力單位之間的比值為50-90:0.5-1:2000-5000:1。

本發明第三方面提供了如上所述的含酶組合物在從胰腺樣品中分離單細胞中的應用。

通過上述技術方案，本發明能夠實現單細胞的高收率和高活率提取，特別是胰腺組織，攻克了現有胰腺組織單細胞收率和活率均較低的難題，為胰腺組織單細胞的分離指明了方向，有利于促進對胰腺組織的進一步研究。

附圖說明

圖1是使用一種含酶組合物從正常胰腺組織分離單細胞的結果圖；

圖2使用根據本發明具體實施方式的含酶組合物從正常胰腺組織分離單細胞的結果圖；

圖3至圖5分別是使用不同的參比組合物從正常胰腺組織分離單細胞的結果圖。

具體實施方式

在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應當理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值范圍，這些數值范圍應被視為在本文中具體公開。