[發(fā)明專利]一種特異性引物及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811593856.9
• 申請(qǐng)日: 2018-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN109868324B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝華;李曉穎;陳昌龍;田宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京知本村知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

1.一種檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）亞種Pco(P. carotovorum subsp. odoriferum)的方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

（1）提取待測(cè)生物樣品的基因組DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為模板，利用分子檢測(cè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

所述分子檢測(cè)引物對(duì)為：

上游引物srlE-F1：5’- TGACTGTGGTGGAACACTTCG - 3’，

下游引物srlE-R1：5’- CAGCCAGTGATAAACCAACCG - 3’；

（3）對(duì)所述擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，當(dāng)特異性地?cái)U(kuò)增出674 bp的產(chǎn)物，即可判斷所檢的病原菌株為P. carotovorum subsp. odoriferum。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的擴(kuò)增的反應(yīng)體系以20 μL計(jì)，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L所述引物各1μL，待測(cè)生物樣品基因組DNA 1 μL，用無菌水補(bǔ)足至20 μL。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述的擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的方法為：瓊脂糖凝膠電泳法。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電泳法具體為：取5 μL所述的擴(kuò)增的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，電壓為4-5 V/cm，電泳40 min后經(jīng)GoldView染色于紫外線下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其片段大小對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。

6.如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述待測(cè)生物樣品選自培養(yǎng)的細(xì)菌系，待測(cè)作物發(fā)病部分收集的細(xì)菌樣品、胡蘿卜軟腐果膠桿菌侵染后發(fā)病的植物軟腐組織樣品。