[發明專利]重組人源Ⅲ型膠原蛋白、表達菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201811590564.X
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN111363029B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 趙健烽;高力虎;馮麗萍;黃建民
• 申請（專利權）人: 江蘇江山聚源生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

本發明公開了一種重組人源Ⅲ型膠原蛋白、表達菌株及其構建方法。所述的重組人源Ⅲ型膠原蛋白含有498個氨基酸，理論分子量約54.5kd，構建的重組人源Ⅲ型膠原蛋白表達菌株能夠有效穩定和大量地表達重組人源Ⅲ型膠原蛋白。本發明的重組人源膠原蛋白具有良好的親水性及穩定性，其結構與天然膠原蛋白基因序列相應部分100％相同，應用于人體當中不會造成免疫排斥，可以廣泛應用于生物醫用材料、化妝品等領域。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種重組人源III型膠原蛋白、表達重組人源III型膠原蛋白的畢赤酵母工程菌及其構建方法。

背景技術

膠原(Collagen)是脊椎動物體內最重要的結構蛋白，約占蛋白總量的25～30％。作為細胞外基質中含量最豐富的蛋白，膠原是結締組織和幾乎所有薄壁器官間隙組織中最主要的結構蛋白，起著穩定組織和器官并維持其結構完整的作用。由于天然膠原蛋白不易溶于水，且使用的通常為牛或豬來源的膠原，分子量大小不等，性質非常復雜，難于進行進一步的加工，存在動物病毒隱患，限制了其作為生物材料在醫療器械等領域的應用。因此，研究通過基因構建技術，利用生物反應器表達重組膠原蛋白來解決這些問題，且已經取得良好進展。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是一種外源蛋白表達系統，既具有原核表達系統操作簡易、易于培養、生長速度快、表達量高、成本低等優點，還具有原核生物表達系統不具有的對外源蛋白的修飾如糖基化、蛋白磷酸化等特點。在過去的20年中已有200多種不同蛋白在畢赤酵母中實現了成功表達，其中許多產品已被廣泛應用于臨床的診斷治療和科研工作中。在畢赤酵母表達系統中外源基因不是存在于自主復制的表達載體中，而是和表達載體一起通過同源重組整合在酵母染色體上，隨染色體一起復制和遺傳，不會發生外源基因的丟失現象；畢赤酵母具有強烈的好氧生長偏愛性，可實現細胞高密度培養，利于大規模工業化生產；畢赤酵母可高水平分泌表達外源蛋白，發酵產物的累積不會對其產生毒副作用，并且畢赤酵母自身分泌到培養基中的蛋白很少，便于純化。

發明內容

本發明的目的在于提供一種親水性優異的重組人源III型膠原蛋白，以及分泌表達該蛋白的畢赤酵母工程菌及其構建方法，能高效、安全地進行重組人源III型膠原蛋白的胞外分泌表達。

實現本發明目的的技術方案如下：

本發明的重組人源III型膠原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本發明的重組人源III型膠原蛋白的編碼基因Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。

本發明構建的重組人源III型膠原蛋白質粒ppic9K-Ⅲα498aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示，通過將重組人源III型膠原蛋白的編碼基因Ⅲα498aa雙酶切連接至ppic9K載體的EcoR I和Not I間構建而成。

本發明構建的分泌表達重組人源III型膠原蛋白的菌株為巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris JY0301，保藏編號為CGMCC No.16462，該菌種已于2018年9月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。所述的巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris JY0301通過將Sac I酶切得到的線性化重組人源Ⅰ型膠原蛋白質粒ppic9K-Ⅲα498aa誘導入巴斯德畢赤酵母中構建而成。

本發明從已知序列的人體膠原蛋白基因III型的螺旋區中選擇水溶性、穩定性強的核苷酸序列，將優選基因片段插入畢赤酵母表達質粒中，轉化畢赤酵母篩選得到高表達畢赤酵母基因工程菌，經過初步發酵及純化步驟，得到高純度的重組類人膠原蛋白。本發明的重組人源III型膠原蛋白具有良好的親水性及穩定性，其結構與天然膠原蛋白基因序列相應部分100％相同，應用于人體當中不會造成免疫排斥，在生物醫用材料、化妝品等領域具有潛在的應用前景。

附圖說明

圖1為人Ⅲ型α鏈膠原蛋白氨基酸的疏水性分析圖。