[發明專利]哈茨木霉高活性孢子粉制備方法

在審

• 申請號: 201811587186.X
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109536433A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 朱彭玲;侯勇;王強鋒;夏中梅;劉武;王贇;陳春;許艷;曾顯斌
• 申請（專利權）人: 四川省蘭月科技有限公司
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N1/14;C12N1/04;C12R1/885
• 代理公司: 成都立信專利事務所有限公司 51100
• 代理人: 馮忠亮

本發明為哈茨木霉高活性孢子粉制備方法，包括：將哈茨木霉菌株進行逐級擴大發酵，從一級種、二級種、三級種的制備生產，到采用分階液體發酵法生產高濃度哈茨木霉厚垣孢子發酵液，然后對所得發酵液進行濃縮，并添加不同的功能助劑及填料進行干燥處理，得到哈茨木霉高活性孢子粉。本發明使得哈茨木霉厚垣孢子有效活菌數達到2×10⁹cfu/g及以上，具有高活性、貨架期長、萌發率高、快速適應土壤環境等優點。

技術領域

本發明涉及一種哈茨木霉厚垣孢子發酵技術及高活菌數孢子粉制備方法。

背景技術

哈茨木霉具有多種生防及促生性能，其效果好、環保安全，越來越受到市場歡迎。而哈茨木霉孢子具有耐貯存、便于運輸、易于施用等特點，因此，為實現哈茨木霉的商品化，制備高濃度、高活性、低成本哈茨木霉孢子粉成為制劑開發的重點。

哈茨木霉有兩種孢子形式，一種是菌絲側枝上生出的分生孢子，另一種是菌絲直接分裂而來的厚垣孢子。目前，市場上商業化的哈茨木霉產品多為分生孢子制劑，分生孢子容易培養，產量大，但分生孢子抗逆能力差，制劑貨架期短，田間應用效果不穩定；而厚垣孢子抗逆性強、存活期長、易于加工貯存、田間應用效果穩定并顯著高于其分生孢子制劑，但不易培養，商品化的木霉菌厚垣孢子制劑在國內外非常少。

常用的哈茨木霉孢子粉制備方法，一是將哈茨木霉固體培養物風干或烘干，粉碎后，通過過篩或風力分級等不同方式收集；二是直接水洗、過濾、低溫干燥等方法進行哈茨木霉孢子收集。這些收集方法各有優缺點，若采用第一種方法，培養物烘干和干燥的總次數為n，最終得到孢子數量比起始培養物減少了10 n次方倍；若采用第二種方法，雖然保證了產物孢子存活率，但工藝繁瑣，干燥時間較長，能耗較高，成本大幅增加，削弱了產品的市場競爭能力。

發明內容

本發明目的在于提供一種 制備工藝簡單，成本低，產物孢子存活率高的本發明的哈茨木霉高活性孢子粉制備方法。

本發明上述目的通過以下技術方案予以實現：

一種哈茨木霉高活性孢子粉制備方法，該方法包括以下步驟：

（1）一級種制備，是將哈茨木霉接種到固體平板培養基上，待菌絲布滿培養皿，完成一級種制備；

（2）二級種制備，是將一級種接種到制備好的液體培養基中，搖床培養，完成二級種制備；

（3）三級種制備，是將二級種接種到液體培養基中，發酵罐培養，完成三級種制備；

（4）哈茨木霉厚垣孢子發酵，是將三級種接種到厚垣孢子液體培養基中，發酵罐分兩階段培養，完成哈茨木霉厚垣孢子發酵培養；

所述哈茨木霉厚垣孢子發酵第一個階段培養24～48h后，補充微量元素，調整發酵液pH、培養溫度、進氣量等液體發酵參數，進入第二個階段發酵培養，培養24～48h后完成哈茨木霉厚垣孢子發酵。

步驟（1）中，固體平板培養基為馬丁氏（Martin）培養基，其組成成分為：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，1%孟加拉紅水溶液3.3mL/L，瓊脂18～20g/L，最后補水定溶至1L，121℃高壓滅菌20min，培養條件為：培養溫度為28～30℃；培養時間為4～7d。

步驟（1）中，固體平板培養基為PDA培養基，其組成成分為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂18～20g/L，最后補水定溶至1L，121℃高壓滅菌30min，培養條件為：培養溫度為28～30℃；培養時間為4～7d。

步驟（1）中，固體平板培養基為馬丁培養基，其組成成分為：磷酸二氫鉀1g/L，葡萄糖10 g/L，硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨5 g/L，1%孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂18～20g/L，最后補水定溶至1L，121℃高壓滅菌20min，培養條件為：培養溫度為28～30℃；培養時間為4～7d。