[發明專利]一種維持穩定性、高滴度病毒抗原生產的懸浮細胞病毒的培養方法

在審

• 申請號: 201811585082.5
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109536437A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 張濤;劉月;何召慶;李如珩;徐婉英;武俊蘭;王永偉;孫聰;張春輝
• 申請（專利權）人: 內蒙古必威安泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02;C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

本發明提供了一種維持病毒抗原生產穩定性，提高病毒有效含量的懸浮細胞病毒的培養方法，該方法在細胞培養階段使用無血清培養方法，一次換液后降低了細胞代謝物對細胞生長的影響及后期病毒生產的干擾，換液后加入硫酸葡聚糖等有效起到提高病毒感染敏感性及細胞分散的作用，后期接毒換液體系中加入PEG6000及高鈣溶液提高了接毒效率并大幅增加了口蹄疫病毒的穩定性。制備的病毒液滴度可高達10^7.0?10^9.01ogTCID₅₀/mL，完全抗原146S含量可達6ug/ml以上且培養的口蹄疫病毒更穩定。

技術領域

本發明屬于細胞的培養和維持，以及病毒抗原的制備領域，特別涉及維持穩定性、高滴度病毒抗原生產的懸浮細胞病毒的培養方法、培養的病毒、制備含該病毒抗原的疫苗組合物。

背景技術

利用動物細胞培養技術生產病毒的過程是指使用液體培養基在特定容器中大規模培養動物細胞,然后接入病毒使其在細胞中大量增殖的過程。1928年，Maitland創建利用組織培養的方法體外繁殖病毒的技術。1949年Enders利用Hela細胞體外培養脊髓灰質炎病毒并進行疫苗生產,這標志著動物細胞培養技術正式應用于疫苗生產領域。1962年,Capsti等將BHK貼壁細胞馴化為生長穩定、對口蹄疫病毒敏感的BHK懸浮細胞,這使得懸浮培養技術首次成功應用于獸用疫苗生產。1965年,Telling等首先嘗試將基于BHK懸浮細胞的大規模生物反應器體系(30L)應用于口蹄疫疫苗工業化生產。1985年,懸浮培養工藝己成為口蹄疫疫苗生產中普遍采用的方法。生產能力上,口蹄疫疫苗生產企業的制造工藝也在不斷升級。早在十年前,英國Wellcome公司就已成功將生產規模擴大到5000L。目前,20000L生物反應器已經投入使用,將顯著降低生產成本并提高疫苗產品的生產質量。2011年由我國農業部發布的第1708號公告中己明確指出,自2012年起采用滾瓶等傳統方式生產的獸用疫苗生產線將停止受理GMP驗收的申請。憑借細胞生長環境均一、培養操作簡單可控、大規模體系中容易放大、清潔、對環境損害較小和生產成本較低等優勢,懸浮細胞培養必將成為未來產業發展的新方向。

但是，伴隨著BHK懸浮細胞大規模培養在病毒培養工業化上的應用，一些問題也隨之放大，其中最突出也最具有迷惑性的現象就是BHK懸浮細胞在病毒培養上病毒數量、質量高低與培養細胞的密度、狀態關系不穩定。往往細胞生長狀態良好但會出現培養出的病毒質量較差的現象發生。就此國內外大量的科研院所與疫苗生產企業都做了大量的研究工作，目前較為普遍的解決手段主要有調整接毒量，調整接毒時間，更換培養基等幾類，然而目前尚沒有一個系統、穩定、符合大規模生產條件的可行解決方法。

現有技術主要問題在于，細胞培養與病毒培養割離評判，現有技術主要將精力放在前期細胞培養的培養密度及細胞生長狀態上了，然而實際情況是細胞密度高時病毒培養后病毒量并不一定多。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明提供了一種維持穩定性、高滴度病毒抗原生產的懸浮細胞病毒的培養方法，其中，所述方法包括：步驟(1)將懸浮細胞進行稀釋傳代，培養，使得懸浮細胞處于傳代后細胞密度為0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml，得到懸浮細胞種子；步驟(2)在生物反應器中接入所述步驟(1)中所述懸浮細胞種子，培養至所述懸浮細胞密度達到≥1-2×10⁶cells/毫升；步驟(3)從所述步驟(2)中所述細胞密度達到1-2×10⁶cells/ml時的懸浮細胞分離掉培養基，替換加入無血清DMEM/F12培養基進行重懸，所述無血清DMEM培養基由以下組分組成：DMEM/F12液體培養基，pH為7.0～7.2，含有1-3μg/ml胰島素、1～10μg/ml轉鐵蛋白、0.2～0.8μg/ml硫酸葡聚糖；步驟(4)培養所述懸浮細胞，使其適應所述無血清DMEM培養基生長環境，之后，加入終濃度0.01-0.3％v/v的PEG6000，再按MOI＝0.01-0.1接種口蹄疫病毒；以及步驟(5)繼續培養，加入CaCL₂溶液，終濃度為6-12mM。培養，收毒。