[發明專利]一種目標DNA富集的方法和應用

有效

• 申請號: 201811583375.X
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109355288B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 王永利;宋卓
• 申請（專利權）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;彭家恩

本申請公開了一種目標DNA富集的方法和應用。本申請的目標DNA富集方法包括，蛋白核酸復合物制備步驟，將同源重組酶與待測樣本的單鏈DNA組裝成蛋白核酸復合物；同源性重組步驟，采用帶有生物素標記的與目標DNA具有同源性的雙鏈DNA探針與蛋白核酸復合物反應；生物素標記分離步驟，包括利用雙鏈DNA探針中的生物素標記，將與之結合的同源性單鏈目標DNA分離、富集。本申請的富集方法，采用雙鏈DNA探針和同源重組酶能靶向富集待測樣本中的單鏈目標DNA；并且效率高、均勻性和穩定性好，特別適合于多靶標DNA或者拷貝數較低的目標DNA的富集。本申請富集方法采用的雙鏈DNA探針制備方法簡單、易操作，且成本低。

技術領域

本申請涉及DNA富集領域，特別是涉及一種目標DNA富集的方法和應用。

背景技術

新一代測序技術(NGS)和平臺的快速發展和應用使得多區域同時測序成為可能。盡管全基因組測序成本正在不斷下降，但選擇感興趣的目標基因或區域進行測序和分析仍然更加符合當前實際和成本效益。因此，目標DNA富集技術成為新一代測序技術前的最常用技術之一。

目前常用的目標區域富集技術主要有如下幾種：1)基于特異性引物擴增的方法；2)基于寡核苷酸探針雜交捕獲的方法；3)基于反向探針雜交的方法。這三種常用方法都有其各自的優勢和劣勢。

基于引物特異性擴增的方法一般比較直接方便，但是對于目標區域特別多的情況，需要采用多組引物對進行多重擴增，而多重擴增時往往會發生各個特異性引物之間錯誤擴增的情況，并且多重擴增難以保障每一對引物的擴增效率。

基于寡核苷酸探針雜交捕獲的方法能夠檢測大批量的目標區域。常應用在人全外顯子的捕獲測序中。該方法能夠捕獲并檢測多種變異類型，如單核苷酸變異、小的插入和缺失，甚至拷貝數變異等等。但是該方法中雜交捕獲的試劑和探針價格比較昂貴，并且雜交捕獲的時間要長，一般都要16小時到48小時。

基于反向探針雜交的方法是指設計一段兩端含有目標區域兩側序列互補序列的寡核苷酸探針。與目標分子雜交并延伸連接后形成單鏈環狀。再通過探針上的通用序列設計引物進行擴增。該方法具有特異性引物擴增和寡核苷酸雜交捕獲的部分優勢，探針設計復雜，雜交效率和分子利用率并不高。

因此，為了滿足日益廣泛的基因測序需求，研發一種更有效的目標DNA富集試劑或方法，是本領域的研究重點。

發明內容

本申請的目的是提供一種新的目標DNA富集的方法和應用。

為了實現上述目的，本申請采用了以下技術方案：

本申請的一方面公開了一種目標DNA富集的方法，包括以下步驟，

蛋白核酸復合物制備步驟，包括將同源重組酶與待測樣本的單鏈DNA組裝成穩定的蛋白核酸復合物；

同源性重組步驟，包括采用帶有生物素標記的與目標DNA具有同源性的雙鏈DNA探針與蛋白核酸復合物反應，在同源重組酶的作用下，雙鏈DNA探針與單鏈的目標DNA結合；

生物素標記分離步驟，包括利用雙鏈DNA探針中的生物素標記，將與之結合的同源性單鏈目標DNA分離、富集。

其中，同源重組酶與單鏈DNA組裝成蛋白核酸復合物，可以參考常規的同源重組酶與單鏈DNA結合時采用的組裝試劑和方法，在此不作具體限定。