[發(fā)明專利]免疫細胞擴增方法與免疫細胞培養(yǎng)基

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811580039.X
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109593712A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 吳揚哲;何均儀
• 申請（專利權）人: 廣東暨德康民生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 王術蘭

本發(fā)明公開了一種免疫細胞擴增方法與免疫細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明通過在人Vγ9Vδ2T細胞的擴增培養(yǎng)過程中添加白介素?15和維生素E，與傳統(tǒng)的擴增方法相比，能夠提高人Vγ9Vδ2T細胞的增殖效率與細胞純度，培養(yǎng)得到的人Vγ9Vδ2T細胞的抗凋亡能力更強，細胞存活時間更長，并且殺傷性功能因子NKG2D、IFN?γ、TNF?α、CD107a的表達水平更高，從而對腫瘤細胞的殺傷能力更強。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種免疫細胞擴增方法與免疫細胞培養(yǎng)基。

背景技術

免疫細胞治療已成為全世界醫(yī)療領域內對難治性疾病(如惡性腫瘤)進行治療的新的重要醫(yī)療手段，比如采用CAR-T細胞對B細胞淋巴瘤進行治療。對科學界和醫(yī)療界而言，獲得質量穩(wěn)定可靠、功能優(yōu)良的免疫細胞對獲得良好的臨床治療效果非常關鍵。

人Vγ9Vδ2T細胞是僅存在于靈長類和人中的一類具有抗腫瘤、抗感染功能的T細胞亞群。人Vγ9Vδ2T細胞可用于患有腫瘤、難治性傳染病及免疫功能失衡疾病的人群的免疫細胞治療或免疫功能重建。

目前對人Vγ9Vδ2T細胞的擴增方法主要有兩大類：

第一類現(xiàn)有擴增技術是在外周血單核細胞(PBMCs)的培養(yǎng)基中添加IL-2和TCRγδ的單克隆抗體。這種方法的主要缺點是外周血中的兩類γδT細胞(Vδ1細胞亞群和Vδ2細胞亞群)都被擴增，而Vδ1細胞亞群具有免疫抑制功能，因此不適用于免疫細胞治療。

第二類現(xiàn)有擴增技術是在PBMCs的培養(yǎng)基中添加IL-2和磷酸鹽小分子化合物如唑來膦酸。這種方法可以得到純度較高的Vδ2亞群的γδT細胞，可以用于免疫細胞治療，這是目前國內外擴增人外周血人Vγ9Vδ2T細胞的常用方法。但是該方法的缺點是：細胞培養(yǎng)擴增的周期為14天左右，擴增出來的人Vγ9Vδ2T細胞的存活時間較短(能繼續(xù)存活7天左右)，細胞抗凋亡能力不強，對腫瘤細胞的殺傷能力不強等。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的首先在于提供一種免疫細胞擴增方法，能夠提高人Vγ9Vδ2T細胞的增殖效率與細胞純度，培養(yǎng)得到的人Vγ9Vδ2T細胞的抗凋亡能力較強，細胞存活時間長，同時對腫瘤細胞的殺傷能力較強。

本發(fā)明的目的還在于提供一種免疫細胞培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基對人Vγ9Vδ2T細胞進行培養(yǎng)，能夠提高人Vγ9Vδ2T細胞的增殖效率與細胞純度，培養(yǎng)得到的人Vγ9Vδ2T細胞的抗凋亡能力較強，細胞存活時間長，同時對腫瘤細胞的殺傷能力較強。

本發(fā)明的目的還在于提供一種免疫細胞刺激擴增培養(yǎng)基，能夠從外周血單個核細胞中選擇性的擴增出人Vγ9Vδ2T細胞，擴增得到的人Vγ9Vδ2T細胞的純度高，殺傷能力與抗凋亡能力較強。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明首先提供一種免疫細胞擴增方法，包括：

步驟1、從人體外周血中提取外周血單個核細胞；

步驟2、提供免疫細胞刺激擴增培養(yǎng)基，采用所述免疫細胞刺激擴增培養(yǎng)基對所述外周血單個核細胞進行重懸，得到細胞懸液；

所述免疫細胞刺激擴增培養(yǎng)基包括免疫細胞培養(yǎng)基以及添加于所述免疫細胞培養(yǎng)基中的膦酸類化合物；所述免疫細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基以及添加于所述基礎培養(yǎng)基中的白介素-2、白介素-15以及維生素E；

所述步驟1與步驟2的順序可調；

步驟3、將所述細胞懸液接種到細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)60-100小時；

步驟4、采用所述免疫細胞培養(yǎng)基進行換液，后續(xù)培養(yǎng)過程均采用所述免疫細胞培養(yǎng)基進行。

可選的，所述基礎培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基；所述膦酸類化合物包括唑來膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、利塞膦酸、米羅磷酸中的一種或多種。