[發(fā)明專(zhuān)利]一種褐飛虱Vg多肽及其多抗制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811579110.2
• 申請(qǐng)日: 2018-12-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109897090B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭榮兒;許益鵬;俞曉平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K7/08
• 分類(lèi)號(hào): C07K7/08;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發(fā)明公開(kāi)了一種褐飛虱Vg多肽及其多克隆抗體的制備方法。所述的Vg多肽的氨基酸序列為：NPASNSESNQRSSH。其多克隆抗體制備步驟如下：（1）褐飛虱Vg蛋白抗原表位分析；(2)褐飛虱Vg多肽設(shè)計(jì)與合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗褐飛虱Vg多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗褐飛虱Vg多肽的抗體。本發(fā)明得到的褐飛虱Vg多肽多克隆抗體特異性好、純度高，可與褐飛虱Vg蛋白發(fā)生特異性結(jié)合發(fā)應(yīng)，可用于褐飛虱Vg蛋白的相關(guān)研究，如其特性、功能、表達(dá)譜和含量的分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢測(cè)，具體是一種兔抗褐飛虱Vg多肽多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)

Vg全稱為vitellogenin，為卵黃原蛋白，在昆蟲(chóng)卵子發(fā)生等生殖過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。褐飛虱是農(nóng)業(yè)重要害蟲(chóng)，對(duì)褐飛虱的Vg進(jìn)行研究或檢測(cè)對(duì)于褐飛虱的防治具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

（1）本發(fā)明的目的在于提供一種Vg多肽，其序列為：NPASNSESNQRSSH。

（2）本發(fā)明的另一目的在于提供一種特異性好、純度高、可與組織或細(xì)胞中天然Vg蛋白特異識(shí)別的Vg多肽多克隆抗體及其制備方法。

（3）所述的Vg多肽多克隆抗體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

步驟一：在合成所述多肽序列時(shí)，在其N(xiāo)端增加一個(gè)半胱氨酸，方便與載體蛋白偶聯(lián)，用多肽自動(dòng)合成儀合成Vg修飾多肽，純化后與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成Vg修飾多肽-KLH復(fù)合蛋白；

步驟二：將乳化后的Vg修飾多肽-KLH復(fù)合蛋白在兔背部皮下注射，初次免疫后，進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫；

步驟三：收集、分離得到含有兔抗褐飛虱Vg修飾多肽抗體的血清；

步驟四：將抗血清通過(guò)Vg多肽親和層析柱進(jìn)行肽親和純化，得到Vg多肽抗體；

步驟五：對(duì)Vg多肽抗體進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)；

步驟六：通過(guò)Western Blot對(duì)Vg多肽抗體的特異性進(jìn)行鑒定。

附圖說(shuō)明

圖1為Western Blot圖，圖中免疫印跡的目的條帶大小在200kDa左右，與Vg蛋白的理論分子量（227.8kDa）大小一致。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術(shù)方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

實(shí)施例一 ：褐飛虱Vg序列的分析與Vg多肽的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GenBank上的褐飛虱Vg序列（登錄號(hào)：AEL22916），已知褐飛虱Vg蛋白序列包含2045個(gè)氨基酸，利用DNAstar軟件中的Protean程序模塊對(duì)褐飛虱Vg蛋白特性進(jìn)行分析，得知該蛋白分子量為227786.41道爾頓，等電點(diǎn)為8.32，為堿性蛋白，進(jìn)一步分析該蛋白氨基酸序列的抗原性、親水性、表面可能性等特征，從中篩選到一段序列為NPASNSESNQRSSH的多肽序列適合用作抗原（339aa-352aa）。為便于與載體蛋白交聯(lián)，增加多肽的免疫原性，在上述多肽的C末端增加一個(gè)半胱氨酸C，故最終待合成的多肽序列為NPASNSESNQRSSHC。多肽合成由多肽自動(dòng)合成儀合成，合成的多肽用高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)純度，純度為87.2%，用MS 質(zhì)譜儀檢測(cè)多肽的分子量，其分子量為1617.40。

實(shí)施例二： 多肽與載體蛋白交聯(lián)