[發明專利]一種快速測定全細胞生物催化合成乙偶姻的方法

有效

• 申請號: 201811577884.1
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109856127B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 羅義勇;刀婭;楊娟
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;C12P7/26;C12R1/01
• 代理公司: 昆明人從眾知識產權代理有限公司 53204
• 代理人: 沈艷尼

本發明公開了一種快速測定全細胞生物催化合成乙偶姻的方法，屬于生物檢測技術領域；本發明將全細胞生物催化反應合成的乙偶姻與顯色劑混合進行顯色反應，測定反應后混合液的OD₅₂₂，并根據乙偶姻標準品的吸光度標準曲線，計算合成樣品中乙偶姻含量；本發明方法具有直觀、簡便快速、重復性好和檢測成本低等特點，適用于工業化應用。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，特別涉及一種快速測定全細胞生物催化合成乙偶姻的方法。

背景技術

乙偶姻（Acetoin，AC），又名為3-羥基-2-丁酮，是一種淡黃色或無色液體，具有令人愉快的奶油香氣。根據JECFA（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，聯合國糧農組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家委員會）和美國FDA（Food andDrug Administration，食品藥品監督管理局）規定，乙偶姻是一種公認安全（GenerallyRecognized as Safe，GRAS）的食品級香料，添加到食物中，可提升食物中的奶香味。同時，乙偶姻是美國能源部優先開發的平臺化合物之一，廣泛應用于功能材料、手性藥物和化學中間體合成等領域。

乙偶姻天然痕量存在于葡萄、草莓、蘋果、香蕉、蜂蜜、咖啡和奶酪等食物中，同時是眾多微生物的次生代謝產物。在微生物細胞中，糖酵解后產生的丙酮酸，在α-乙酰乳酸合酶作用下生成α-乙酰乳酸，后者在α-乙酰乳酸脫羧酶（Alpha-acetolactatedecarboxylase，Ald）催化作用下生成乙偶姻。目前，ald基因被廣泛克隆進大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸乳球菌和丙酮丁醇梭菌等模式微生物中，通過增強ald基因表達，以提高乙偶姻產量（Kandasamy et al., 2016；馬紅武等，2014；Shen et al., 2016；張顯等，2015）。

全細胞生物催化是利用微生物細胞將底物轉化為特定產物，其本質是利用微生物細胞內的酶進行催化；相比酶催化，全細胞生物催化免去了酶分離純化等過程，并且不需要額外提供催化過程中所需要的輔因子，所以有效降低了催化成本、提高了催化效率。構建ald基因和其他基因同時過表達菌株，以這些基因工程菌進行全細胞生物催化反應，不僅能提高反應的穩定性，還能極大提高乙偶姻產量（Kandasamy et al., 2016；Li et al.,2014；李欣等，2017）。

目前，生物產乙偶姻檢測方法主要有氣相色譜法、蒸餾比色法和高效液相色譜法等，這些方法均較為繁瑣復雜。

發明內容

為克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種快速測定全細胞生物催化合成乙偶姻的方法，在堿性條件下，乙偶姻能與α-萘酚和肌酸制備的顯色劑反應生成紅色物質，且在一定范圍內乙偶姻的量和紅色物質顏色的深淺程度成正比關系，可用于比色測定，因此檢測OD₅₂₂值的變化就可測定樣品中乙偶姻生成的量，即本發明是將全細胞生物催化反應合成的乙偶姻與顯色劑混合進行顯色反應，測定反應后混合液的OD₅₂₂，并根據乙偶姻標準品的吸光度標準曲線，計算合成樣品中乙偶姻含量；該方法具有直觀、簡便快速、重復性好和檢測成本低等特點。

所述顯色劑是按體積比1:1～2:1的比例，將質量體積濃度0.07～0.5%肌酸-NaOH溶液與質量體積濃度0.5～2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，現配現用。

上述方法的具體步驟如下：

（1）底物α-乙酰乳酸的制備