[發明專利]一種基于微孔陣列芯片的數字PCR擴增裝置及其使用方法

有效

• 申請號: 201811570499.4
• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN111349555B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 岳耀斐;王曉飛;張志峰
• 申請（專利權）人: 成都萬眾壹芯生物科技有限公司
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/00;C12Q1/6851
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 張麗;董建林

本發明提供了一種基于微孔陣列芯片的數字PCR擴增裝置及使用方法。裝置包括上層的密封蓋、中層的微孔陣列、和下層的生化傳感器芯片。使用時，注入微孔中的待測液體接觸孔內下方的傳感器，且不同微孔中的液體被密封蓋密封而相互隔離。本發明可以將PCR反應分隔在上萬個微小單元，微孔內進行單分子樣本的PCR擴展反應，通過檢測PCR過程中釋放出的氫離子、磷酸根離子或焦磷酸根離子的濃度變化來檢測陽性反應單元的數量，進而準確對DNA樣品進行定量。本發明采用高度集成的半導體芯片來完成數字PCR的檢測，不僅將反應體系大幅縮小，儀器小型化，并克服了對熒光激發和檢測裝置的依賴，且避免了熒光染料或熒光探針的使用，大幅降低了數字PCR的儀器及試劑成本。

技術領域

本發明屬于核酸檢測領域，尤其涉及一種基于微孔陣列芯片的數字PCR檢測方法。

背景技術

現代生物學研究，特別是醫學研究時常涉及對核酸定量分析的需求。比如檢測血液中某些游離DNA及其含量，可以指導某些癌癥的臨床診斷，以及監控癌癥的治療效果。以往的定量主要采取熒光定量PCR進行相對定量，即選取一個表達穩定的基因的轉錄物作為參照，來評判目的核酸的量的高低。但這種方法易受非目的核酸分子(背景噪音)的干擾，只適用于定性或者低精度檢測，無法滿足某些含量特別稀少的目標核酸分子的檢測。

數字PCR(dPCR)則能通過大規模的平行PCR擴增，將微弱的擴增信號從背景噪音中提煉出來，以“終點信號的有或無”來統計被擴增的分子的個數。到目前為止，已經發展出了各式各樣的dPCR裝置，主要有孔板式和液滴式。

孔板式dPCR就是在足夠數量的同尺寸微孔陣列排布的平板上離散化核酸分子，實現數字化擴增。例如：ThermoFisher公司推出的QuantStudioTM?3D?dPCR系統就是采用這種方式。它在一塊10mm邊長正方形平板上蝕刻出高達20000個六角形微孔，每個微孔容積0.8nL，實現微孔間隔離，通過簡單涂刷上樣，每個微孔有1個左右的目標核酸分子；PCR后就可檢測孔中熒光信號，通過泊松分布計算目標分子的個數。

液滴式dPCR則是通過數以萬計的單分散性小液滴來分割樣本，液滴借助疏水的管道和油相液體，把DNA分散與各個油包水小液滴，一個液滴理論上只含有一個左右的DNA分子；DNA擴增后可以轉移到熒光檢測裝置進行最終檢測。該方法的缺點是液滴容易在PCR過程或者轉移過程中出現液滴相互匯合的情況，導致結果不準確。

以上各種dPCR的技術都采用熒光信號來讀取結果，這就要求配套裝置中含有昂貴的熒光激發裝置和耗材、熒光高分辨率檢測裝置。另外，光信號的相互污染也會增加判斷結果難度。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種基于微孔陣列芯片的數字PCR擴增方法。

為解決上述技術問題，本發明提供一種基于微孔陣列芯片的數字PCR擴增裝置，包括微孔陣列芯片本體，所述微孔陣列芯片本體包括密封蓋、微孔陣列以及生化傳感器，所述密封蓋置于所述微孔陣列上方，用于密封微孔陣列的微孔并使各個微孔之間相互隔離，所述生化傳感器置于微孔底部，所述密封蓋或生化傳感器上設有用于向微孔內溶液提供電壓的電極。

進一步，所述微孔陣列中含有0.1萬～1000萬個微孔，每個微孔的容積為1fL～10pL。

進一步，所述生化傳感器的表面涂有氫離子敏感材料、磷酸根離子或焦磷酸根離子敏感材料。

進一步，所述氫離子敏感材料為SiO₂、Al₂O₃、HfO₂、TiO₂、Ta₂O₅、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、三乙氧基硅基十一醛中的一種或多種疊層。

進一步，所述磷酸根離子或焦磷酸根離子敏感材料為磷酸離子有機膜ISM或分子探針。