[發明專利]用于治療卵巢早衰的胎盤間充質干細胞制劑

有效

• 申請號: 201811568552.7
• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN109652366B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 許曉椿;李容;肖海蓉;劉冰
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02;A61K35/28;A61P15/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種細胞制劑，其是通過使胎盤間充質干細胞混懸于0.9%氯化鈉溶液中配制成的細胞混懸液；該細胞制劑的細胞濃度為1~10×10⁶個細胞/ml；所述0.9%氯化鈉溶液中還添加枸櫞酸鎂和磷脂，添加枸櫞酸鎂的量是使鎂離子濃度為5mmol/L，添加磷脂的濃度為0.2mg/ml；該細胞制劑是通過包括方法制得的：將細胞傳代所得間充質干細胞轉移至離心管中，離心，棄上清，加入0.9%氯化鈉溶液重懸，制得細胞制劑。

2.根據權利要求1的細胞制劑，其中細胞濃度為1~5×10⁶個細胞/ml。

3.根據權利要求1的細胞制劑，其中細胞濃度為1~3×10⁶個細胞/ml。

4.根據權利要求1的細胞制劑，其中所述間充質干細胞是通過包括如下步驟的方法制備得到的：

(1)胎盤小葉的處理：將胎盤置于白瓷盤中，用組織清洗液沖洗以去除胎盤瘀血，剪取20g胎盤小葉組織于鋼杯中，使用組織清洗液清洗兩遍，并浸泡5min后，稱取15g較好的組織于100mm玻璃皿中；加10ml組織清洗液，剪碎小葉至0.2cm³左右大小，加100ml組織清洗液攪勻后300目濾網過濾，再反復此操作以用組織清洗液清洗兩次從而除去血細胞；

(2)混合酶消化及終止：將清洗后的小葉組織加入37℃預熱的15~30ml混合酶消化液中充分混勻后，搖床37℃、100rpm振蕩消化30min，消化結束后，向組織液中添加2ml的FBS以終止消化；

(3)收集原代細胞：向上一步驟所得組織液中添加50ml組織清洗液，混勻，300目過濾，收集細胞液；如此反復兩次洗滌消化后的組織，兩次的濾液合并至離心管中，1500rpm離心8min；移去上清，加適量組織清洗液重懸并補充至200ml，1500rpm離心8min；移去上清，細胞沉淀加DMEM-F12重懸至30ml，100um濾網過濾后，再用10ml的DMEM-F12沖洗濾網，得40ml細胞懸液，作為原代細胞；

(4)原代細胞凍存：使細胞懸液1800rpm，離心10min，留取細胞沉淀及下液5ml，重懸后緩緩加入凍存液10ml，邊加邊搖勻；將所得細胞懸液分裝至9只2ml凍存管中，每管1.5ml，置預冷的程序降溫盒中，使用程序降溫儀器程序降溫，再將細胞轉入液氮存儲罐中凍存；

(5)細胞復蘇：取2管凍存的細胞，37℃快速解凍，將細胞移至15ml離心管，加8ml完全培養基點滴復蘇；接著1200rpm離心5min后，去上清，加5ml完全培養基重懸；每管細胞接種于1個T75培養瓶中，補充完全培養基至30ml，置CO₂培養箱，37℃，5%CO₂，飽和濕度中培養；每隔3-4天用完全培養基進行一次全換液，復蘇12天后根據克隆形成情況進行計數，至細胞密度不低于3000個細胞/cm²時可進行接下來的傳代；

(6)細胞傳代：取P0代細胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至細胞大部分脫落，加5ml完全培養基終止消化，使細胞轉移至離心管中，1400rpm離心5min，棄上清，加5ml完全培養基重懸后計數接種至培養瓶，細胞密度為8000~12000個細胞/cm²，置CO₂培養箱，37℃，5%CO₂，飽和濕度中培養至細胞密度達90%以上，完成從P0代至P1代的細胞傳代；依次重復上述操作以分別進行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的細胞傳代，得到各代間充質干細胞。

5.根據權利要求4的細胞制劑，在制備間充質干細胞的過程中，還包括：

(7)針對步驟(6)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(8)將步驟(6)所得傳代后的各代胎盤間充質干細胞于液氮中凍存；和

(9)建立包含以上信息的胎盤干細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(8)的凍存細胞進行關聯。

6.根據權利要求4的細胞制劑，所述的組織清洗液是包含1%雙抗的0.9%生理鹽水。