[發(fā)明專利]一種單鏈式核酸多重檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811565830.3
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109439730B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐婷;劉文斌;姜曉;范婭涵;姚春艷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6834
• 分類號: C12Q1/6834
• 代理公司: 重慶強大凱創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50217
• 代理人: 王攀

1.一種非疾病診斷的單鏈式核酸多重檢測方法，其特征在于：包括如下步驟，

步驟1：將不同類型的DNA探針與不同種類的聚苯烯微球進行偶聯(lián)反應(yīng)，形成DNA探針-聚苯烯微球復(fù)合物；聚苯烯微球為經(jīng)過活化且標記有不同比例的熒光染料的聚苯烯微球，聚苯烯微球的直徑為5~10 μm；聚苯烯微球的活化采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液，N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）溶液和活化緩沖液進行活化或者聚苯烯微球的活化采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶液，N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）溶液和活化緩沖液進行活化；

步驟2：將超順磁納米微球與上述DNA探針-聚苯烯微球復(fù)合物進行羧基化偶聯(lián)，形成磁微球-DNA探針-聚苯烯微球三聯(lián)復(fù)合物；磁微球-DNA探針-聚苯烯微球三聯(lián)復(fù)合物使用前于4℃下存儲；

步驟3：將待檢標本的單鏈核酸分子與上述磁微球-DNA探針-聚苯烯微球三聯(lián)復(fù)合物置于帶有緩沖液的反應(yīng)管中進行反應(yīng)，反應(yīng)的條件為52 ℃下雜交1 h，得雜交產(chǎn)物；雜交時的緩沖液為pH 6.3的PBS溶液；

步驟4：將雜交后的反應(yīng)管至于磁場中，除去上清液后重懸沉淀；

步驟5：在步驟4的反應(yīng)管中加入雙鏈特異性核酸酶以降解雜交產(chǎn)物，釋放聚苯烯微球；雙鏈特異性核酸酶降解雜交產(chǎn)物時的反應(yīng)條件為37 ℃下反應(yīng)1h；

步驟6：根據(jù)聚苯烯微球的數(shù)量，確定待檢測核酸分子的量和類型；

其中，DNA探針1的序列為：5’-gtaagaaaaa caaggcacag ccagcagctg ctaacacagganatagcagc ccggtcagcc aaaattaccc catagtgcaa aatgcacagg ggcaatgggt acaccaggccttgtcaccta ggaccttgaa tgcatgggtc aaagtagtag aagaaaaagc tttcagccca gaagtgatacccatgtttac agcattatca gaaggagcca ccccacagga tttaaacacc atgctaaaca cagtggggggtcatcaagca gctatgcaaa tactaaaaga agccatcaat gatgaagctg cagaatggga tagattacatccagtgcatg cagggcctat tgcaccaggc cagatgaggg aaccaagggg aagtgacata gcaggaactactagtaccct tcaggaacaa atagcatgga tgacgagcaa cccacctatc ccagtaggag aaatttacaaaagatggata atcttgggat taaataagat agtaagaatg tatagccct-3’；

DNA探針2的序列為：5’-gtggcctact accgcggtct tgacgtgtct gtcatcccggccagtggcga tgttgtcgta

gtggcaactg atgctctcat gaccggcttt accggcgatt tcgactcggtgatagactgcaacacgtgtgtcacccagac ggtcgacttc agccttgatc ct-3’。