[發明專利]一種MMR蛋白表達缺失檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811564603.9
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN111351937A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 錢其軍;葉真龍;李新春;邵文琪;張曉霞
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療集團有限公司;上海白澤醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/6841
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種MMR蛋白表達缺失檢測試劑盒及其檢測方法，采用基于抗體偶聯的磁珠的陰性富集法從人的外周血中分離循環腫瘤細胞，再聯合免疫細胞化學染色法和熒光原位雜交法對富集到的細胞進行鑒定，實現了從富集的循環腫瘤細胞中鑒定DNA損傷修復蛋白MMR的目的，為腫瘤病人提供用藥指導依據，試劑盒組分簡潔合理，檢測方法高效靈敏，具有廣闊的應用前景和巨大的市場價值。

技術領域

本發明屬于生物醫學檢測領域，涉及一種MMR蛋白表達缺失檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

錯配修復(Mismatch repair system，MMR)基因屬于生物進化過程中的看家基因，能夠修復DNA錯配堿基，以確保基因組DNA復制的高保真性，有利于降低自發性突變，維持基因組的穩定性。MMR系統在生物界很保守，大腸桿菌的MMR系統包括MutS、MutL、MutH三個蛋白。人類中對應的同源基因有MSH2、MLH1、PMS2、MSH6。微衛星序列，又稱簡單重復序列，是一些短而重復的DNA序列，一般由1-6個核苷酸組成，可連續重復20-60次甚至更多次。大多數為二核苷酸或三核苷酸重復單位，拷貝數不同由此決定微衛星序列長度不盡相同。MMR系統失控會導致序列中微衛星序列的不穩定性(MSI)或編碼功能蛋白的基因突變，進一步可導致MMR蛋白表達缺失(dMMR)，從而改變正常細胞功能，從而引發腫瘤。一般認為MMR功能缺陷與多種腫瘤，尤其是與人類遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC)，部分散發性大腸癌密切相關。HNPCC是一種常染色體顯性遺傳的家族性腫瘤綜合征，家族中異常基因攜帶者早期(平均年齡44歲)多發生右側結直腸癌，同時，子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌、腦瘤、膽管癌、黑色素癌等其它部位的惡性腫瘤發病率亦明顯高于正常人群。MSI根據程度可以被分成3類：高微衛星不穩定性(MSI-H，MSI-high)、低衛星不穩定性(MSI-L，MSI-low)、微衛星穩定(MSS)。針對II期和III期結腸癌患者進行的大樣本隨機臨床研究發現，MSI-H患者較MSS或MSI-L患者的預后更好，但MSI-H患者對化療藥物氟尿嘧啶療效欠佳，而MSS和MSI-L患者可從氟尿嘧啶輔助治療中獲益。此外，MSI-H/dMMR與體細胞基因突變密切相關，MSI-H/dMMR的癌細胞相比于MSS/pMMR的癌細胞更易累積體細胞基因突變，因此能產生大量新抗原(Neoantigens)，進而誘導產生以大量腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs，Tumor Infiltrating Lymphocyte)為特征的活化型免疫微環境。MSI-H/dMMR的癌細胞更易選擇性過表達多種免疫檢查點蛋白，包括PD-L1等，因此也更適用于PD-1/PD-L1單抗的免疫治療。

癌癥要早發現、早診斷、早治療，目前一系列臨床檢驗手段，諸如血清腫瘤標志物鑒定、醫學影像掃描、組織病理學切片、內窺鏡探查等已得到廣泛應用。MMR蛋白常用的檢測方法是免疫組化方法(IHC)，檢測腫瘤細胞中的MLH1，MSH2，MSH6和PMS2蛋白的表達情況；若結果顯示任一蛋白完全缺失，則判讀為dMMR；若顯示無蛋白缺失，則判斷為MMR蛋白表達正常(pMMR)。

但作為惡性腫瘤診斷“金標準”的組織病理學切片往往根據穿刺或術后取出的腫瘤組織才能鑒定，且技術要求較高，無法做到反復多次、長期或隨時獲取，此外，該方法還具有一定的創傷性且不能準確判定是否有轉移情況發生，迫切需要建立一種新的高效的鑒定辦法。