[發(fā)明專利]一種增加弗托葡糖桿菌HD924生物量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811560522.1
• 申請(qǐng)日: 2018-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN109456924B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李華;劉宇鵬;肖延銘;楊生玉;楊衛(wèi)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P7/26;C12R1/01
• 代理公司: 連云港聯(lián)創(chuàng)專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32330
• 代理人: 劉剛

本發(fā)明公開了一種增加弗托葡糖桿菌HD924生物量的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過在弗托葡糖桿菌HD924中利用組成型啟動(dòng)子sldAp過量表達(dá)Bacillus lentus 168來源的葡萄糖脫氫酶基因gdh，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加一定濃度的L?葡萄糖，使重組菌細(xì)胞干重提高了21.2％。過量表達(dá)gdh基因的重組弗托葡糖桿菌二羥基丙酮產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度、甘油利用率、胞內(nèi)NADH濃度均有顯著的提升。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種增加弗托葡糖桿菌HD924生物量的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

弗托葡糖桿菌(Gluconobacter frateurii)HD924為革蘭氏陰性菌，專性好氧，屬于葡糖桿菌屬。該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為：CGMCC No.5397。該菌株具有優(yōu)良的二羥基丙酮生產(chǎn)性能，好氧條件下二羥基丙酮產(chǎn)量可以在達(dá)到170g/L以上(CN，201110388519)。該菌株已經(jīng)在長(zhǎng)興制藥股份有限公司進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，是生產(chǎn)二羥基丙酮的工業(yè)菌株之一。劉宇鵬等(Bioresource technology 2013,142:384-389)研究發(fā)現(xiàn)，弗托葡糖桿菌HD924發(fā)酵過程中最大生物量OD560只有8.7。提高發(fā)酵過程中的生物量能夠提高菌體生產(chǎn)二羥基丙酮的生產(chǎn)強(qiáng)度，目前促進(jìn)弗托葡糖桿菌生長(zhǎng)的方法主要是優(yōu)化菌體的培養(yǎng)基組成和生長(zhǎng)條件。

葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，[EC:1.1.1.47]GDH)，是一種NAD+和NADP+輔酶依賴型蛋白。GDH能夠催化葡萄糖脫氫氧化成葡萄糖酸，并將氧化態(tài)的NAD+和NADP+還原為NADH和NADPH，促進(jìn)NAD+和NADP+再生，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供還原力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中弗托葡糖桿菌HD924在發(fā)酵二羥基丙酮過程中的生物量低的缺陷，提供一種增加弗托葡糖桿菌HD924生物量的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

在弗托葡糖桿菌HD924中通過構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBBR-sldAp-gdh過量表達(dá)Bacilluslentus 168來源的葡萄糖脫氫酶基因gdh，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加一定濃度的L-葡萄糖。所述的重組質(zhì)粒pBBR-sldAp-gdh是甘油脫氫酶基因啟動(dòng)子sldAp、gdh基因克隆在pBBR1MCS-4質(zhì)粒的SacI和EcoRI的酶切位點(diǎn)之間，其物理圖譜如附圖1所示。所述的gdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列中包含該基因自身的終止子。所述的過量表達(dá)是通過弗托葡糖桿菌來源的甘油脫氫酶基因組成型啟動(dòng)子sldAp控制gdh在弗托葡糖桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行組成型表達(dá)。sldAp的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮過程中，過量表達(dá)gdh的重組菌與野生菌株HD924相比，細(xì)胞干重提高了21.2％，發(fā)酵12h、18h和24h的胞內(nèi)NADH分別提高了3.1、2.6和1.8倍。發(fā)酵48h，二羥基丙酮的生產(chǎn)強(qiáng)度提高了14.2％。

附圖說明

附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是pBBR-sldAp-gdh質(zhì)粒物理圖譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例

本實(shí)施例中以G.frateurii HD924為實(shí)驗(yàn)菌株，Bacillus lentus 168購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心。