[發明專利]一種基于邏輯判斷的原子尺度DNA測序方法

有效

• 申請號: 201811559707.0
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109652519B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 賈瑜;王紅艷;牛春要;趙玉;關紹康
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 成都其高專利代理事務所(特殊普通合伙) 51244
• 代理人: 廖曾

本發明提供了一種DNA測序方法，該方法采用單壁碳納米管作為測序通道，且該通道的長度每次僅能容納兩個堿基對，測序通道內的堿基對只能有4種組合，分別為(CG，CG)、(CG，AT)、(AT，CG)、和(AT，AT)，相應地，測序通道內堿基對間的氫鍵個數分別為6、5、5、4，不同數量的氫鍵使堿基對碳納米管的作用力不同，進而影響碳納米管的聲子譜。對于具有5個氫鍵的組合，需對其相鄰堿基進行邏輯判斷，實現對DNA的單個堿基對的測序。目前常規固態納米孔由于通道太長無法實現對單個堿基分辨，而采用二維納米孔雖能對單個堿基或堿基對進行檢測，但檢測信號分辨率過低。該測序方法有效解決了常規固體納米孔存在的不足，提高了單對堿基的分辨率。

技術領域

本發明涉及的是一種基于邏輯判斷和聲子譜測量的單壁碳納米管對雙鏈 DNA的測序方法，通過檢測碳納米管的聲子振動圖譜(實驗上通過檢測納米管的拉曼光譜)，實現在原子層次對雙鏈DNA分子的快速測序，該發明屬于第四代 DNA測序方法。

背景技術

DNA測序技術是一種分析特定DNA片段的堿基對排列方式的技術。該測序技術具有快速、精準和低成本等優勢，有利于DNA測序的廣泛應用，如用于疾病診斷、生物技術以及對重要物種的基因測序等。

納米孔測序(nanopore sequencing)是第四代DNA測序技術。該技術是利用電泳驅動DNA分子通過納米孔，并通過阻塞電流法、電容法及隧道電流法等來檢測不同類型堿基通過納米孔時導致的物理參數的變化。目前制備納米孔的材料主要分為兩類，一類是生物納米孔，即天然的或人工改造過的蛋白質分子，如α溶血素、MpsA蛋白和phi29DNA聚合酶等。另一類是采用微加工技術制備的固態納米孔，如氮化硅、聚乙烯亞胺(PEI)、二硫化鉬和石墨烯等。盡管生物納米孔可以識別單鏈DNA上的單個堿基，但蛋白質容易受環境的影響，如環境的 pH值、溫度和機械振動等均能使蛋白質發生變性，除此之外，蛋白質納米孔具有不能承受較高的電壓、錯誤率較高和易老化等缺點，這些因素均限制了生物納米孔在DNA測序中的應用。固態納米孔不具備生物納米孔中存在的上述缺點，更重要的是可以將其進行批量生產和器件集成。然而，由于傳統的固態納米孔測序通道太長，無法實現對單個堿基的分辨。目前已經通過大量的理論計算發現，以石墨烯為代表的新一代二維材料納米孔，用于DNA測序具有諸多優點，但由于DNA容易粘附在孔側，且檢測的電流信號強度也不夠高，導致很難對單堿基進行分辨。人們發現單壁碳納米管通道內簡單的環境和完美均勻的石墨壁能為 DNA測序提供一個良好的平臺，近年來，單壁碳納米管也被用來進行DNA測序。然而，目前用于DNA測序的單壁碳納米管與傳統固態納米孔一樣，均具有測序通道太長的特點，也無法實現對單個堿基的分辨。到目前為止，采用固態納米孔進行DNA測序的目標還遠遠沒有實現。

通過理論計算的研究證實，納米孔測序可以通過測量離子電流、電子隧穿電流或平面內電流來實現超高速測序，但這一方案還未得到實驗證明。這是因為，要實現利用納米孔測序的目標，必須克服兩大障礙。首先，DNA在納米孔的易位速率相較于實驗中所能測得的信號帶寬和噪聲水平來說仍太快。因此，要想實現納米孔測序，DNA易位的速度必須減慢或降低信號噪聲。其次，核苷酸或堿基的二級和三級結構在納米孔附近或內部形成，導致納米孔測序的不同堿基之間的信號重疊，進而難以實現對單堿基分辨率。因此，為了提高DNA測序的分辨率，一方面需要避免DNA在納米孔附近形成新的二級或三級結構，同時也要增加DNA 在納米測序通道內的滯留時間，這是目前DNA測序技術需要解決的關鍵技術問題。

發明內容

本發明首次提出從原子尺度的邏輯關系出發，利用DNA不同堿基對間氫鍵數量的不同，從而對碳納米管的作用力不同，進而影響碳納米管的聲子振動模式，最終需結合碳納米管振動模式的差異實現對DNA單堿基對的測序。對碳納米管聲子振動模式的檢測實際上是對其內氫鍵數量的檢測，而氫鍵是生物分子間最強的一種分子間作用力，相比于常規固體納米孔對電子電流信號的檢測，對氫鍵信號的檢測可以大大提高信號強度。本發明的目的在于提供一種新的DNA測序方法，彌補采用現有固態納米孔進行DNA測序的不足，使固態納米孔測序成為一種快速、低成本、高精度的DNA測序方法。