[發(fā)明專利]一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811559164.2
• 申請日: 2018-12-19
• 公開（公告）號: CN110055282A
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 寧志豐;劉復(fù)興;吳基良;武倩
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北科技學(xué)院
• 主分類號: C12N15/869
• 分類號: C12N15/869;A61P35/00
• 代理公司: 武漢荊楚聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42215
• 代理人: 喻志勇

本發(fā)明公開了一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法，通過將I型單純皰疹病毒17+株基因組上的ICP4基因啟動子置換成結(jié)腸癌特異性啟動子、再將I型單純皰疹病毒17+株基因組上ICP34.5基因剔除并插入IL?12表達序列，得到HSV^CEA+IL?12。本發(fā)明提供了一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法，該新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL?12采用CEA啟動子及剔除ICP34.5的構(gòu)建法實現(xiàn)高選擇性地在結(jié)腸癌細胞內(nèi)繁殖，確保該病毒不感染正常組織細胞；同時，插入IL?12表達序列增強該新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL?12的免疫調(diào)節(jié)作用，確保受損的結(jié)腸癌細胞被機體自身的免疫細胞徹底清除干凈。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體的說是涉及一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

溶瘤病毒療法是一種利用病毒特異性地在腫瘤細胞中復(fù)制繼而殺傷腫瘤細胞，并刺激機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的新型腫瘤治療方法。相比其他腫瘤治療方法，溶瘤病毒療法具有復(fù)制高效、殺傷效果好和毒副作用小等特點，已經(jīng)成為腫瘤治療研究領(lǐng)域的新熱點。

美國Amgen公司的Ⅰ型單純皰疹重組病毒T-VEC(talimogenelaherparepvec)在治療晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期臨床試驗中顯示出良好的腫瘤治療效果，并成為首個獲得美國FDA批準(zhǔn)上市的溶瘤病毒類治療藥物。溶瘤病毒在黑色素瘤治療上取得的成功引起了科學(xué)家對溶瘤病毒療法更廣泛的關(guān)注，溶瘤病毒的研究得到了進一步的推動。至今用于溶瘤治療的病毒高達數(shù)十種，包括Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplexvirustype 1，HSV-1)、腺病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、麻疹病毒、人類免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus，VSV)和流感病毒等。溶瘤病毒按發(fā)展歷程大致可分為4種類型：(1)野生型病毒株或自然減毒株，如新城疫病毒、柯薩奇病毒和呼腸孤病毒等；(2)基因工程選擇性減毒株，主要是刪除病毒某些關(guān)鍵基因而實現(xiàn)病毒復(fù)制的腫瘤選擇性，如ONYX-015、G207等；(3)基因加載型病毒株，主要是在前述兩種溶瘤病毒基礎(chǔ)上加載外源治療基因，如加載粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的JX-594和T-VEC等；(4)轉(zhuǎn)錄靶向型病毒株，即在病毒必需基因前插入組織或腫瘤特異性啟動子來控制溶瘤病毒在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制，如G92A等。

結(jié)腸癌是一種常見惡性腫瘤。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一種主要在結(jié)腸癌細胞表達的分泌性蛋白，本發(fā)明利用結(jié)腸癌特異性表達CEA的特點構(gòu)建選擇性在結(jié)腸癌細胞感染繁殖的新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL-12。該病毒不感染正常結(jié)腸粘膜細胞及其它正常組織，可靜脈給藥，具有高效、特異性強等優(yōu)點。對血液中的循環(huán)結(jié)腸癌細胞及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌灶均有殺滅作用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述背景技術(shù)中提出的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

本發(fā)明公開了一種選擇性殺滅結(jié)腸癌細胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟一、構(gòu)建pdICP4-promoter質(zhì)粒：PCR分別擴增I型單純皰疹病毒17+株ICP4基因啟動子上游和下游的側(cè)翼序列后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI/SpeI分別消化后獲得ICP4基因啟動子的上游側(cè)翼序列、下游側(cè)翼序列及去除ICP4啟動子的I型單純皰疹病毒17+株，并用互補的連接酶Linker 1和Linker 2將所述ICP4基因啟動子的上游側(cè)翼序列和下游側(cè)翼序列連接起來，并把連接后的產(chǎn)物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位點創(chuàng)建質(zhì)粒pdICP4-promoter；