[發明專利]一種用于檢測細胞早期凋亡的Annexin V熒光標記的方法

在審

• 申請號: 201811550905.0
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111334518A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 徐兆超;苗露;喬慶龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明提供了一種用于檢測細胞早期凋亡的Annexin V熒光標記的方法，具體的標記方法如下：(1)構建pET?22b?SNAP?Annexin V基因融合質粒載體；(2)通過原核表達并純化pET?22b?SNAP?Annexin V融合蛋白；(3)用熒光小分子標記融合蛋白并純化。Annexin V蛋白是目前發現的最佳PS結合受體之一，表現為對PS結合的高選擇性和高結合力，熒光標記的Annexin V是目前檢測早期細胞凋亡的最常用試劑之一。本發明創造了Annexin V熒光標記的新方法，首先通過基因工程方法將SNAP標簽蛋白與Annexin V蛋白融合、表達并純化，隨后用連接SNAP蛋白專一底物BG基團的小分子熒光探針標記融合蛋白進而標記Annexin V，通過細胞成像或者流式細胞儀檢測凋亡細胞。本發明對細胞凋亡過程研究具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于生物分析檢測領域，具體涉及一種用于檢測細胞早期凋亡的AnnexinV熒光標記的方法。

背景技術

細胞凋亡是生物體維護內環境穩定而發生的程序性死亡。細胞凋亡異常會導致腫瘤、神經退行性和自身免疫性等多種疾病的發生。基于原位、實時和靈敏度高的特點，熒光檢測細胞凋亡能夠示蹤凋亡過程，幫助解析凋亡異常相關疾病發生機理、篩選新藥和建立有效的治療方法。正常細胞中磷脂酰絲氨酸(PS)位于細胞質膜的內側，而在細胞凋亡早期，PS從細胞質膜的內側翻轉到細胞質膜的外側，是細胞凋亡開始的重要信號。因此，PS被用作檢測細胞凋亡可靠標志物，通過識別細胞外膜的PS就可以檢測凋亡細胞。Annexin V蛋白是目前發現的最佳PS結合受體之一，表現為對PS結合的高選擇性和高結合力，而熒光標記的Annexin V就成為目前檢測早期細胞凋亡的最常用試劑之一。

Annexin V主要通過共價連接小分子有機熒光染料或融合熒光蛋白的方式實現熒光標記。其中有機熒光染料通過與Annexin V蛋白上的側鏈氨基發生偶聯反應實現標記，但這種反應沒有選擇性，很難控制Annexin V上標記的位點和連接上的熒光染料分子數目。研究表明，多于兩個熒光染料分子的標記會導致Annexin V失活。不影響Annexin V活性的熒光單分子標記工藝實現困難，因此商品化的高效熒光染料標記的Annexin V試劑價格昂貴。熒光蛋白采用遺傳編碼融合的方式，雖然解決了定點和定量標記的問題，但熒光蛋白光穩定性差、波長范圍有限而使得應用受到限制，同時也存在尺寸太大而影響Annexin V活性的顧慮。

蛋白標簽熒光標記法是目前常用的蛋白質定點標記的方法，作用過程是首先將標簽蛋白與目標蛋白的融合表達，隨后帶有底物基團的熒光小分子通過與標簽蛋白的專一性作用實現標記。SNAP標簽蛋白是常用的蛋白標簽，SNAP標簽蛋白能夠與O⁶修飾的苯甲基鳥嘌呤(常稱作BG基團)通過親和反應共價連接，因此連接有BG基團的熒光小分子能夠專一、快速的與SNAP標簽蛋白反應，進而標記目標蛋白。

發明內容

本發明開發了一種用于檢測細胞早期凋亡的Annexin V熒光標記的方法。首先通過基因工程方法構建SNAP標簽蛋白與Annexin V蛋白融合的質粒載體，然后原核表達并純化，用連接SNAP蛋白專一底物BG基團的小分子熒光探針標記融合蛋白并且純化，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞。本發明對細胞凋亡過程研究具有重要的意義。

本發明所述的一種用于檢測細胞早期凋亡的Annexin V熒光標記的方法，具體的標記方法如下：

(1)構建PET-22b-SNAP-Annexin V基因融合質粒載體

(2)通過原核表達并純化PET-22b-SNAP-Annexin V融合蛋白

(3)用熒光小分子標記融合蛋白并純化

一種用于檢測細胞早期凋亡的Annexin V熒光標記的方法，pET-22b-SNAP-Annexin V融合基因質粒載體構建方法如下：