[發明專利]用于檢測大腸埃希氏菌的核酸試劑、試劑盒及系統

有效

• 申請號: 201811550861.1
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109576385B
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 張志強
• 申請（專利權）人: 北京卓誠惠生生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12M1/34;C12R1/19
• 代理公司: 11447 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 蘇瑞;耿超

1.一種用于檢測大腸埃希氏菌的核酸試劑，其中，所述核酸試劑包括分別彼此獨立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQ ID NO.27-38所示的探針；

其中，所述SEQ ID NO.27-38所示的探針具體如下：

SEQ ID NO.27：ccctttct-FAM-gttact-FAM-gccaa，

SEQ ID NO.28：cact-FAM-gagt-FAM-accaagggcat，

SEQ ID NO.29：ccactat-JOE-gcgacattaaat-JOE-ccag，

SEQ ID NO.30：acaccgat-JOE-gtggt-JOE-cccct，

SEQ ID NO.31：accat-JOE-cctct-JOE-gccggagcta，

SEQ ID NO.32：aatt-CY5-gtctggctatct-CY5-ggttt，

SEQ ID NO.33：actattcat-CY5-gcttt-CY5-caggaccact，

SEQ ID NO.34：ccttt-CY5-caggcagcaagcgt-CY5-cc，

SEQ ID NO.35：aatgcgt-CY5-ttctatggcgt-CY5-gtcggga，

SEQ ID NO.36：ttcccgct-JOE-gctgt-JOE-cgtgatggtt，

SEQ ID NO.37：acccattcct-ROX-ggtat-ROX-gccggtgct，

SEQ ID NO.38：ccat-ROX-gacacgat-ROX-gcgcagact。

2.根據權利要求1所述的核酸試劑，其中，SEQ ID NO.1所示的引物的含量為0.5μM，分別由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自為0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM、0.9～1.1μM、0.4～0.6μM和0.9～1.1μM，分別由SEQ IDNO.27-38所示的探針的含量各自為0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.1～0.3μM。

3.根據權利要求1所述的核酸試劑，其中，所述核酸試劑還包括陽性內質控；所述陽性內質控含有SEQ ID NO.25-26所示的引物、SEQ ID NO.39所示的探針和pET28a質粒；

其中，所述SEQ ID NO.39所示的探針為ctttct-ROX-cgct-ROX-cgacttgcat。

4.一種用于檢測大腸埃希氏菌的試劑盒，該試劑盒含有權利要求1～3中任意一項所述的核酸試劑。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還含有反應體系緩沖液、DNA聚合酶、鎂離子、dNTP和水中的至少一種。

6.權利要求1～3中任意一項所述的核酸試劑在制備用于檢測大腸埃希氏菌的試劑盒中的用途。

7.根據權利要求6所述的用途，其中，所述大腸埃希氏菌包括腸致病性大腸埃希菌EPEC、腸出血性大腸埃希氏菌EHEC、腸產毒性大腸埃希氏菌ETEC、腸侵襲性大腸埃希氏菌EIEC和腸粘附性大腸埃希氏菌EAEC。

8.一種用于檢測大腸埃希氏菌的系統，該系統包括裝載有權利要求1～3中任意一項所述的核酸試劑的PCR儀、計算裝置和輸出裝置，所述PCR儀包括第一熒光通道、第二熒光通道、第三熒光通道和第四熒光通道；所述第一熒光通道為FAM熒光通道，所述第二熒光通道為JOE熒光通道，所述第三熒光通道為CY5熒光通道，所述第四熒光為ROX熒光通道；所述計算裝置包括存儲器和處理器，所述存儲器中存儲有計算機程序，所述處理器被配置為執行所述存儲器中存儲的計算機程序，以實現如下的判別：

空白對照和陰陽性對照成立，則檢測結果有效；

a)若第一熒光通道有Tm值為61℃或65℃對應的熔解峰曲線且第一熒光通道有Tm值為69℃對應的熔解峰曲線則判定為腸致病性大腸埃希菌EPEC陽性；

b)若第一熒光通道有Tm值為61℃或65℃對應的熔解峰曲線且第二熒光通道有Tm值為58℃和62℃對應的熔解峰曲線則判定為腸出血性大腸埃希氏菌EHEC陽性；

c)若第三熒光通道有Tm值為64.7℃或68.2℃對應的熔解峰曲線則判定為腸侵襲性大腸埃希氏菌EIEC陽性；

d)若第二熒光通道有Tm值為66℃對應的熔解峰曲線且第三熒光通道有Tm值為58℃和61.8℃對應的熔解峰曲線則判定為腸產毒性大腸埃希氏菌ETEC陽性；

e)若第二熒光通道有Tm值為68.9℃對應的熔解峰曲線且第四熒光通道有Tm值為65℃和70℃對應的熔解峰曲線則判定為腸粘附性大腸埃希氏菌EAEC陽性；

f)若第一熒光通道有Tm值為58℃對應的熔解峰曲線或第四熒光通道有Tm值為60℃對應的熔解峰曲線則判定為陽性內質控陽性。