[發明專利]一種快速檢測聚乙二醇修飾蛋白中間體的修飾度的方法

在審

• 申請號: 201811547559.0
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111337482A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 張弨
• 申請（專利權）人: 修正生物醫藥（杭州）研究院有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 盧霞

1.一種快速檢測聚乙二醇修飾蛋白中間體的修飾度的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)對待測樣品進行預處理，方法如下：取待測樣品溶液，去除溶液中干擾兩相法檢測游離聚乙二醇的蛋白組分和小分子雜質組分；

2)采用兩相法，測算步驟1)處理后的樣品溶液中的游離聚乙二醇質量；

3)根據步驟2)的游離聚乙二醇質量推算出待測樣品的聚乙二醇修飾度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，采用硫酸銨沉淀法去除蛋白組分。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，所述的步驟1)中，采用離心法去除小分子雜質組分。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，所述的步驟1)中，采用超濾離心法或分子排阻離心法去除小分子雜質組分。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，所述的步驟1)中，串聯使用硫酸銨沉淀和分子排阻離心分別去除蛋白和小分子雜質組分。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，所述的步驟1)中，串聯使用硫酸銨沉淀和超濾離心分別去除蛋白和小分子雜質組分。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中，測算處理后的樣品溶液中的游離聚乙二醇質量的方法如下：首先將步驟1)處理后的待測樣品和聚乙二醇對照品梯度溶液分別加入到硫氰酸鐵-氯仿兩相體系中；測定氯仿相溶液在510nm波長處的吸光度值；以對照品吸光度值對各點對照品溶液中的聚乙二醇質量擬合標準曲線，并得到曲線參數；將處理后的樣品的吸光度值代入標準曲線，計算出其中游離聚乙二醇的質量。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中，根據步驟2)的游離聚乙二醇質量推算出聚乙二醇修飾度的計算公式如下：

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法，包括如下步驟：

1)對樣品進行預處理，去除溶液中干擾兩相法檢測游離聚乙二醇的蛋白組分和小分子雜質組分，具體操作如下：取樣品溶液，加入硫酸銨，攪拌，使蛋白沉淀；取上清液進行離心，去除小分子雜質，收集液體備用；

2)聚乙二醇對照品溶液的制備：精密稱取分子量與樣品所用相同的聚乙二醇，加水溶解，系列稀釋后定容，制成一系列含量固定的聚乙二醇對照品溶液，放置備用；

3)反應：分別取上述對照品溶液和預處理后的樣品溶液，加入到硫氰酸鐵-氯仿兩相體系中，混勻后靜置，待兩相分層后取出氯仿相溶液；

4)數據測定與計算：測定氯仿相溶液在510nm波長處的吸光度值；以對照品吸光度值對對照品溶液中的聚乙二醇質量擬合標準曲線；將樣品吸光度值代入標準曲線，計算出其中游離聚乙二醇的質量，再計算出聚乙二醇修飾蛋白中間體中的游離聚乙二醇質量；

5)聚乙二醇修飾度計算：根據以上結果計算聚乙二醇修飾度，計算公式如下：

10.如權利要求1-9任意一項所述的方法在檢測樣品溶液中聚乙二醇含量、聚乙二醇殘留量或聚乙二醇修飾度方面的應用。