[發明專利]一種埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201811545363.8
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109678938A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 葉偉;章衛民;劉桃妹;李浩華;李賽妮;黃自磊;朱牧孜;許麗瓊
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C07K1/22
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白及其制備方法。本發明首次采用生物素標記埃博霉素生物合成基因啟動子P3釣取的方法獲得So ce M4埃博霉素生物合成基因簇的轉錄調控蛋白，并采用EMSA實驗驗該轉錄調控蛋白的功能。所得新型埃博霉素生物合成基因簇轉錄調控蛋白可為纖維堆囊菌埃博霉素生物合成轉錄調控及埃博霉素生物合成基因簇的異源表達奠定分子生物學基礎，從而促進埃博霉素的高效生物合成及埃博霉素在生物醫藥方面的廣泛應用。

技術領域：

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白及其制備方法。

背景技術：

纖維堆囊菌是一種次級代謝產物種類豐富的粘細菌，埃博霉素就是一類由纖維堆囊菌產生的具有廣譜高效抗腫瘤活性的十六元大環內酯類化合物。埃博霉素由于其較好的水溶性、較低的副作用、更廣譜的抗腫瘤活性及對耐藥性腫瘤細胞良好的抗腫瘤活性，成為最有望取代紫杉醇的化合物。目前埃博霉素衍生物伊莎匹隆已經被批準用于臨床治療晚期乳腺癌，取得了很好的療效。而且埃博霉素B和埃博霉素D也已經用于臨床實驗但由于埃博霉素產量較低，價格較昂貴，因此限制了其廣泛應用。通過纖維堆囊菌埃博霉素轉錄調控蛋白的過表達，可以有效提高埃博霉素的產量，纖維堆囊菌So ce90、So 0157-2的埃博霉素生物合成基因簇已經鑒定，但目前關于纖維堆囊菌埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白的報道較少。本實驗室從土壤中分離得到了一株產埃博霉素纖維堆囊菌，獲得了埃博霉素生物合成基因啟動子P3并進行功能驗證，本實驗采用生物素對該啟動子P3進行生物素標記，然后采用鏈霉親和素磁珠固定標記的啟動子，然后從本實驗室自主獲得的纖維堆囊菌So ceM4的總蛋白中釣取啟動子P3的結合蛋白，然后采用EMSA進行體外活性功能驗證，為纖維堆囊菌埃博霉素的生物合成轉錄調控奠定基礎。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種纖維堆囊菌So ce M4埃博霉素生物合成基因新型轉錄調控蛋白。

本發明的埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白，其特征在于，所述的埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白是產埃博霉素的微生物的總蛋白中與啟動子P3結合的蛋白，所述的啟動子P3的核苷酸序列為：5'-TGCGATCTTGTGATTCCCCTTCTGATCTTTAAAATTTCCCGATCCCCCAT-3'，具體序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的產埃博霉素的微生物是纖維堆囊菌So ce M4、纖維堆囊菌So ce 90、纖維堆囊菌So0157-2或纖維堆囊菌SMP44。

本發明的第二個目的是提供一種埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白的制備方法，其特征在于，是將產埃博霉素的微生物的總蛋白與啟動子P3混合，選取能與啟動子P3結合的蛋白。

優選，是通過生物素標記啟動子P3，然后通過鏈霉親和素磁珠固定生物素標記的啟動子P3，提取產埃博霉素的微生物的總蛋白，將總蛋白加入固定啟動子P3的鏈霉親和素磁珠中，從中獲得能與啟動子P3結合的埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白。

所述的產埃博霉素的微生物是纖維堆囊菌So ce M4、纖維堆囊菌So ce 90、纖維堆囊菌So0157-2或纖維堆囊菌SMP44。

所述的生物素標記試劑盒購買自碧云天生物科技有限公司。鏈霉親和素磁珠購買自百邁格生物科技有限公司(無錫，中國)。具體埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白獲得步驟為：將通過Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)把生物素標記的dUTP添加到啟動子P3的3'末端。然后將生物素標記的P3啟動子取少量加入到偶聯了鏈霉親和素的磁珠中，用磁力架固定磁珠，棄去上清，加入纖維堆囊菌So ce M4的總蛋白(4mg/mL)，用10mMEDTA pH 8.2和95％甲酰胺進行洗脫，從而獲得埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白，將所得調控蛋白進行SDS-PAGE鑒定，并切割條帶送至輝駿生物技術有限公司(廣州，中國)進行氨基酸測序，從而獲得埃博霉素生物合成基因轉錄調控蛋白的序列。