[發(fā)明專利]一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811544226.2
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109371061A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝宗宜
• 申請（專利權(quán)）人: 靖西市秀美邊城農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46;A01C1/00
• 代理公司: 北京天奇智新知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 牙斐穎

本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。通過超聲波處理種子獲得萌動種子、含目的基因農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、侵染種子與共培養(yǎng)、脫菌與選擇培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植株分子檢測的步驟，獲得轉(zhuǎn)基因植株。使用本發(fā)明方法可有效縮短轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的時間，同時提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。

【背景技術(shù)】

玉米是禾本科玉蜀黍?qū)僖荒晟鷨巫尤~草本植物，是世界上重要的糧食作物之一。隨著世界人口的增長和人們生活水平的不斷提高，對玉米品種和質(zhì)量提出了更高的要求。同時，隨著國外種業(yè)不斷涌入市場，國家對種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，各種生物因素和非生物因素的影響，導(dǎo)致玉米面積大減產(chǎn)。為改善玉米品質(zhì)以確保國家糧食安全、滿足人民更高質(zhì)量的需求，提高市場競爭力，為新能源發(fā)展提供支撐，通過遺傳改良來選育高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)玉米新品種，將成為解決這些問題的關(guān)鍵，同時也是未來玉米育種的重點發(fā)展方向。

單純的傳統(tǒng)育種手段，已暴露出缺點：育種周期長，育種效率較低，且對雜交后代表現(xiàn)型難以預(yù)測，已經(jīng)很難發(fā)展?jié)M足需求，通過分子育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，來提高玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量已成為今后主要的發(fā)展趨勢。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過分子生物學(xué)手段將目的基因轉(zhuǎn)到受體材料中，在短時間內(nèi)獲得所需的生物性狀。它具有定向選擇、改善目標(biāo)性狀高效、精準(zhǔn)的特點，可以縮短育種時間，能在一定程度上加快玉米選育。

隨著越來越多玉米優(yōu)良基因的發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)逐漸在玉米育種中發(fā)展起來。目前，玉米上常用遺產(chǎn)轉(zhuǎn)化方法分為DNA直接導(dǎo)入法和和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。DNA直接導(dǎo)入法主要包括PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法和花粉管通道轉(zhuǎn)化法。其中PEG法和電穿孔法以原生質(zhì)體為受體，由于對原生質(zhì)體再生的依賴而在應(yīng)用上受到很大限制。基因槍法雖然受體廣泛，轉(zhuǎn)化率較高，但外源DNA的整合方式復(fù)雜，常常是多拷貝插入，較易出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化的外源基因片斷不能太大(上限是16-20kb)，轉(zhuǎn)入基因的分離有時呈非孟德爾遺傳等。同DNA直接導(dǎo)入法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法不需要原生質(zhì)體的培養(yǎng)，培育周期短，技術(shù)較成熟，可以轉(zhuǎn)化較大的外源基因片段，外源基因重排少，且以單拷貝或低拷貝插入受體細(xì)胞，穩(wěn)定性好，可利用不同的啟動子控制目的基因在特定的器官進行差異表達，較少出現(xiàn)沉默現(xiàn)象的優(yōu)點。

農(nóng)桿菌的侵染具有趨化性，一般只侵染雙子葉植物和裸子植物，對單子葉植物沒有感染力。近年來，雖然農(nóng)桿菌的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物上成功轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化率仍然不高，此外，由于采用植物外植體(如幼胚、愈傷組織、莖尖等)作為侵染材料，后期需經(jīng)過組織培養(yǎng)技術(shù)才能培育成再生植株，因此整個實驗周期較長。目前，也有對此方法進行改進的，如專利20121012184.1《一種玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法》，通過對玉米種子整體進行侵染，后期采用農(nóng)桿菌侵染的種子直接生根發(fā)芽成完整植株，從而獲得成功轉(zhuǎn)化的植株。雖然該方法在一定程度上，縮短了玉米遺傳轉(zhuǎn)化的時間，但由于種子外部擁有堅硬的種皮保護，侵染效率不高，因此獲得的遺傳轉(zhuǎn)化效率并不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

鑒于上述內(nèi)容，有必要發(fā)明一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，在縮短遺傳轉(zhuǎn)化時間的同時，提高玉米轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化率，將有較大的應(yīng)用價值。為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)種子的處理：玉米種子用體積濃度為45～55％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5～15min后，用無菌蒸餾水清洗2～3次，用無菌濾紙吸干種子表面水分，將種子放入種子培養(yǎng)液中，于40℃～55℃下黑暗中超聲波處理后，靜置10～20min，撈出種子，放入40℃～55℃熱水中浸泡30～50min，得到萌動種子；