[發(fā)明專利]基于氣壓計的免疫傳感器快速分析水中大腸桿菌中的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811542437.2
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109406779B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡霞林;尹大強
• 申請（專利權(quán)）人: 同濟(jì)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N1/40;G01N1/34
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 劉燕武

1.一種基于氣壓計的免疫傳感器快速分析水中大腸桿菌中的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)Ab@cMB的制備：

取Ab、MES和EDC加入到cMB溶液中，搖動反應(yīng)，除去未結(jié)合的Ab，分離洗滌，即得到Ab@cMB，再分散于PBS中儲存?zhèn)溆茫?/p>

(2)PS@PEI@CAT@AuNPs@Ab的制備：

取Ab加入到PS@PEI@CAT@AuNPs溶液中保持過夜，離心分離洗滌，得到PS@PEI@CAT@AuNPs@Ab，再分散于PBS中儲存；

(3)夾心型大腸桿菌免疫傳感器的構(gòu)建：

取不同濃度的大腸桿菌溶液加入到步驟(1)所制備的Ab@cMB溶液中，反應(yīng)，再使用磁體解離上層清液，洗滌除去過量大腸桿菌，再加入步驟(2)所制備的PS@PEI@CAT@AuNPs@Ab，反應(yīng)，所得產(chǎn)物分離洗滌后，得到夾心型大腸桿菌免疫傳感器，再置于PBS中儲存?zhèn)溆茫?/p>

(4)再取步驟(3)所制備的夾心型大腸桿菌免疫傳感器與H₂O₂混合反應(yīng)，產(chǎn)生氧氣，再將所產(chǎn)生氧氣通入壓力計中，測定壓力變化值，即得到不同濃度的大腸桿菌-壓力變化值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

(5)：取待測水體按相同條件重復(fù)步驟(3)-步驟(4)，構(gòu)建夾心型大腸桿菌免疫傳感器與H₂O₂混合反應(yīng)產(chǎn)生氧氣，再通入壓力計中測定出壓力變化值，最后，根據(jù)步驟(4)得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即可分析得出待測水體中的大腸桿菌濃度；

步驟(1)中，Ab的濃度為1ng/mL，MES的濃度為0.05mmol/L，EDC的濃度為0.01mmol/L，cMB溶液的濃度為1mg/mL；

Ab、MES、EDC、cMB溶液和分散用的PBS的添加量之比為5μL：1mL：1mL：300μL：2mL；

步驟(2)中，Ab的濃度為1ng/mL，PS@PEI@CAT@AuNPs溶液的濃度為2mg/mL，Ab、PS@PEI@CAT@AuNPs溶液與分散用的PBS的添加量之比為10μL：2mL：4mL；

步驟(3)中，大腸桿菌溶液加入Ab@cMB溶液后，反應(yīng)的溫度為37℃，時間為40min；

加入PS@PEI@CAT@AuNPs@Ab后反應(yīng)的時間為40min；

步驟(2)中，PS@PEI@CAT@AuNPs通過以下方法制成：先合成具有強磁性的PS@PEI納米球，再將過氧化氫酶和AuNPs成功偶聯(lián)在納米磁珠PS@PEI上，獲得PS@PEI@CAT@AuNPs，接著，將抗體Ab偶聯(lián)PS@PEI@CAT@AuNPs上，制備PS@PEI@CAT@AuNPs@Ab；

步驟(2)中，PS@PEI@CAT@AuNPs的合成方法具體為：

(a)按8mg1,1'-二茂鐵二羧酸計，取1,1'-二茂鐵二羧酸溶解在5mL甲醇中，在陽光下反應(yīng)2小時，直至溶液的顏色從黃色變?yōu)榛疑x心并洗滌后，獲得聚合納米球PS并保存在pH＝7.0的PBS中，備用；

(b)接著，按2mL步驟(a)制備的PS溶液計，取PS溶液與1mL濃度為4mg/mL的PEI在室溫下振蕩混合2h，反應(yīng)結(jié)束后，將制備的PS@PEI離心并用去離子水洗滌三次，重置于PBS中備用；

(c)然后，將5μL濃度為1mg/mL的CAT，1mL濃度為0.05mmol/L并含有0.05％吐溫20的MES和1mL濃度為0.01mmol/L的EDC加入到步驟(b)制備的PS@PEI溶液中，搖動2小時，通過靜電吸附，得到PS@PEI@CAT穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，離心并用去離子水洗滌后，將PS@PEI@CAT分散在PBS溶液中；

(d)最后，取2mL AuNPs加入到步驟(c)制備的PS@PEI@CAT溶液中，搖動2h后，即獲得PS@PEI@CAT@AuNPs；

步驟(3)中，大腸桿菌溶液、Ab@cMB溶液、PS@PEI@CAT@AuNPs@Ab與儲存用的PBS的體積比為1:1:1:1；

步驟(4)中，H₂O₂的濃度為30wt％，H₂O₂與夾心型大腸桿菌免疫傳感器溶液的體積比為1:1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氣壓計的免疫傳感器快速分析水中大腸桿菌中的方法，其特征在于，步驟(1)中，搖動反應(yīng)的時間為2h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于氣壓計的免疫傳感器快速分析水中大腸桿菌中的方法，其特征在于，步驟(4)中，供夾心型大腸桿菌免疫傳感器與H₂O₂混合反應(yīng)的裝置為采用密封蓋封住的反應(yīng)瓶，所述的壓力計為兩端開口的U型氣壓計，所述反應(yīng)瓶通過穿過密封蓋的氣管連接U型氣壓計的一端開口。