[發明專利]一種構建高效枯草芽孢桿菌啟動子的方法

有效

• 申請號: 201811542085.0
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109652417B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 周哲敏;崔文璟;韓來闖;劉中美;周麗;郭軍玲;燕宇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種構建高效枯草芽孢桿菌啟動子的方法，屬于基因工程技術領域。本發明將不同sigma亞基識別的天然啟動子串聯得到一些雙串聯、三串聯啟動子，并在啟動子串聯的基礎之上優化了啟動子核心區之間的間隔序列長度進一步提升了啟動子的活性，最后將啟動子進行不同的RBS設計，不僅驗證了該策略可以提升啟動子和其他基因表達調控元件之間的兼容性，也對外源基因的表達進行了可控的調節。通過本發明提供的方法，我們可以用簡便的啟動子設計和改造方法獲得活性更高、設計性和兼容性更強的啟動子。該方法簡單、易于實現，在構建外源蛋白高效表達系統和合成生物學研究中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種構建高效枯草芽孢桿菌啟動子的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

枯草芽孢桿菌是廣泛應用于表達外源蛋白的革蘭氏陽性模式菌株，其因能夠高效表達外源蛋白在工業酶制劑生產方面有廣泛應用。但是，目前應用的枯草芽孢桿菌啟動子，尤其是天然的內源枯草芽孢桿菌啟動子(如P43啟動子)活性較低、表達外源基因的穩定性較差，這一缺陷嚴重制約了枯草芽孢桿菌在高效表達外源蛋白領域的應用。為了克服這一缺陷，近些年人們一方面利用定向進化的思路對天然啟動子進一步篩選和改造，另一方面利用基因工程方法和合成生物學思路構建人工合成啟動子。其中改造天然啟動子雖然能大幅度提升啟動子活性，但仍無法規避天然啟動子自身的一些缺陷，如表達不穩定、與其他表達調控元件兼容性不強等。因此，構建高效穩定的人工啟動子對于突破天然啟動子活性瓶頸、提升啟動子元件穩定性和兼容性方面有巨大的應用前景。

目前，構建人工啟動子主要有兩種策略，一種是利用天然啟動子為基本骨架，篩選高活性天然啟動子并進行精簡、改造、重排、組合，進而構建出新的包含天然啟動子骨架的高效人工啟動子。另外一種策略是全人工合成隨機的一定長度的DNA序列，克隆到啟動子篩選載體上，借助高通量篩選設備和高通量篩選方法，篩選出眾多隨機序列中具有啟動子功能的全人工合成序列作為啟動子元件使用。這兩種策略各有明顯劣勢，前者依賴高活性的天然啟動子，也需要人們對啟動子的工作原理有較為深入的認識，并且對于串聯啟動子來講，新啟動子如果包含多個重復的序列片段，將會對啟動子和表達載體的穩定性帶來不利影響；后者雖然不需要深入理解啟動子的工作機制，但是從全隨機序列中篩選到目標啟動子需要昂貴的高通量篩選儀器設備，篩選效率低。因此，提供一種構建高效穩定啟動子的方法，對于高效表達外源蛋白具有重要意義。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種調控基因表達的元件，包括人工串聯啟動子和其下游的RBS，所述人工串聯啟動子是將啟動子P_rpoB、P_spoVG和P_sigW中的至少兩個進行串聯，所述啟動子P_rpoB、P_spoVG和P_sigW的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.11所示。

在本發明的一種實施方式中，所述人工串聯啟動子的核苷酸序列如SEQ IDNO.17-SEQ ID NO.27任一所示

在本發明的一種實施方式中，所述人工串聯啟動子的核苷酸序列如SEQ IDNO.29-SEQ ID NO.59任一所示。

在本發明的一種實施方式中，當在P_rpoB和P_spoVG啟動子的核心區之間分別了插入了60bp、75bp的間隔序列，分別獲得如SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33所示的新啟動子P_AW-D60、P_AH-D75。

在本發明的一種實施方式中，當在P_sigW、P_rpoB和P_spoVG的前兩個啟動子的核心區之間分別插入了45bp、75bp的間隔序列，分別獲得如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45所示的新啟動子P_WAH-D45、P_WAH-D75。