[發明專利]條件性誘導豬滋養層細胞Aqp11基因敲除細胞系構建方法及應用

在審

• 申請號: 201811541828.2
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109666648A
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 朱翠;白銀山;陳莊;蔣宗勇;葉金玲;陳子韜
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院農業生物基因研究中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/867;C12N15/65
• 代理公司: 廣州文智專利代理事務所(特殊普通合伙) 44469
• 代理人: 劉敏

1.一種條件性誘導豬滋養層細胞Aqp11基因敲除細胞系構建方法，其特征在于，包括：

分別以pLX-sgRNA-EGFP載體為模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6為引物，擴增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列為模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6為引物進行重疊PCR擴增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；

XhoI和NheI兩個酶雙酶切pLX-sgRNA-EGFP載體和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP載體骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，連接、轉化，構建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP質粒；

pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP質粒進行純化、包裝得到攜帶靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒，利用該慢病毒侵染條件性表達Cas9的豬滋養層細胞系，即構建得到所述條件性誘導豬滋養層細胞Aqp11基因敲除細胞系。

2.根據權利要求1所述的條件性誘導豬滋養層細胞Aqp11基因敲除細胞系的建立方法，其特征在于，所述pLX-sgRNA-EGFP質粒進行鈍化，包括：

步驟201，加入質粒體積的1/10體積的3M醋酸鈉，混勻；

步驟202，加入步驟201溶液體積的2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃靜置30-60min；

步驟203，4℃，12000rpm離心10min，回收沉淀，用5-10倍體積預冷的75%乙醇溶解；4℃，12000rpm離心10min，吸走上清；

步驟205，真空或室溫干燥，無菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。

3.根據權利要求2所述的條件性誘導豬滋養層細胞Aqp11基因敲除細胞系的建立方法，其特征在于，所述包裝得到攜帶靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒包括：

步驟301，293FT細胞鋪板：提前一天在10cm²培養皿中培養293FT細胞，10%293FT細胞培養基培養，當細胞接觸達到70-80%時進行侵染；

步驟302，侵染時，取干凈的1.5mL離心管，加入100-300μLDMEM以及慢病毒包裝質粒pSPAX2、pMD2.G和pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP穿梭質粒，各質粒使用量分別為3-4μg、10-12μg和9-11μg，加入60-80μL轉染試劑，用移液槍混合均勻，15-25℃靜置10-15min；

步驟303，用PBS清洗293FT細胞兩次并加入5-8mL2-10%293FT細胞培養基，滴加混合液；

步驟304，將上述293FT細胞放置37℃細胞培養箱培養，4-6h后棄去培養液，繼續用2-10%293FT細胞培養基培養，37℃、5%CO₂培養箱內培養；

步驟305，經過48h后和經過72h后分別收集病毒液，用慢速離心機以2000rpm離心3min取上清液用0.45μm濾器過濾并標注好放進冰箱4℃保存。