[發明專利]一種用于鈾U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法

在審

• 申請號: 201811537809.2
• 申請日: 2018-12-15
• 公開（公告）號: CN111323591A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 陳紅紅;暴一眾;張旭霞;王夢夢
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種用于鈾U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于：包括其促排效果的篩選及其對Zn²⁺穩態影響的篩選。

2.根據權利要求1所述的鈾U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于，其包括：將MT1/2抗原包被在酶標板上；4℃孵育過夜后用含1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉；洗板后加入一定濃度的U(VI)溶液或Zn²⁺溶液，37℃孵育后洗板；加入一定濃度的螯合劑，37℃孵育后洗板；加入特異性MT1/2單克隆抗體，37℃孵育后洗板；加入酶標二抗，37℃孵育后洗板；加入酶反應底物OPD，室溫避光孵育后加入終止反應液2mol/L硫酸終止反應，然后用酶標儀在490nm處測定吸光度值。

3.根據權利要求1或2所述的鈾U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于，通過下述步驟進行：

(1)包被：用包被緩沖液(碳酸鹽緩沖液)溶解及稀釋包被抗原兔肝MT1/2至工作濃度，加入96孔酶標板中，100μL/孔，4℃包被過夜，所述緩沖液為碳酸鹽緩沖液；

(2)洗板：以PBST為洗液，洗板3次，每次5min，300μL/孔，棄液拍干；

(3)封閉：以1％牛血清白蛋白為封閉液，200μL/孔，4℃封閉過夜；封閉結束后，棄液拍干；

(4)U(VI)或Zn²⁺處理：加入一定濃度的U(VI)溶液和Zn²⁺溶液，100μL/孔，37℃孵育3h；

(5)洗板：同步驟(2)；

(6)螯合劑處理：加入一定濃度的螯合劑，100μL/孔，37℃孵育0.5～3h；

(7)洗板：同步驟(2)；

(8)加一抗：加入一定濃度的鼠抗MT1/2單克隆抗體(一抗)，100μL/孔，37℃孵育1～3h；

(9)洗板：同步驟(2)；

(10)加酶標二抗：加入1:1000～2000倍稀釋的羊抗鼠IgG-HRP(二抗)，100μL/孔，37℃孵育1h；

(11)洗板：同步驟(2)；

(12)顯色：加入新鮮配制的OPD底物顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色15min；

(13)終止反應：加2mol/L H₂SO₄溶液終止顯色反應，50μL/孔；

(14)測定：于酶標儀490nm波長處測定吸光度值A₄₉₀。

4.根據權利要求2或3所述的鈾U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于：所述的U(VI)或Zn²⁺與MT1/2結合后能干擾包被抗原MT1/2與MT1/2單克隆抗體結合，使吸光度值降低50％以上。

5.根據權利要求2或3所述的鈾U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于：當螯合劑有效競爭結合MT1/2上的U(VI)或Zn²⁺進而恢復MT1/2抗原與MT1/2抗體結合的位點時，使吸光度值明顯增加；如果螯合劑結合U(VI)或Zn²⁺的能力小于或等于MT結合U(VI)或Zn²⁺的能力，則不能競爭結合MT上的U(VI)或Zn²⁺而無法增加吸光度值；所述吸光度值增加與否用于評價U(VI)促排藥物的藥效及其對機體Zn²⁺穩態的影響。

6.根據權利要求1～5任一所述的U(VI)促排藥物體外篩選的競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于，所述方法中，反應體系中以pH 9.6 0.05～0.1mol/L CBS作為包被緩沖液，包被抗原MT1/2工作濃度為0.6～2μg/mL，MT1/2抗體工作濃度為0.5～2μg/mL，U(VI)溶液和Zn²⁺溶液的工作濃度為150～600μmol/L，U(VI)和Zn²⁺溶液孵育的溫度和時間各為37℃孵育3h，螯合劑孵育的溫度和時間為37℃孵育0.5～3h，封閉液為含1％牛血清白蛋白的pH7.40.01mol/L磷酸鹽緩沖液，酶標二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，洗液為含0.05％Tween 20、pH 7.40.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBST)，顯色底物為0.4mg/mL鄰苯二胺，以pH 5.5的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制。