[發明專利]一種解淀粉芽孢桿菌菌株及其應用

有效

• 申請號: 201811533298.7
• 申請日: 2018-12-14
• 公開（公告）號: CN111321097B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 張霞;齊建;石增秀;李冬冬;黃亦鈞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/57;C12N9/54;C12R1/07
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本發明屬于基因工程和微生物工程改造技術領域，具體提供了一種高產中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌突變菌株及其應用。所述突變菌的保藏編號為CCTCC NO:M2018835。所述突變菌株能高效表達中性蛋白酶，搖瓶發酵酶活高達9514 u/ml，比出發菌提高的68%，20L罐發酵酶活高達40550 U/mL，比出發菌株提高了59%，取得了意料不到的技術效果。所述突變菌株可廣泛應用于中性蛋白酶的發酵生產，有利于降低該酶的生產成本，促進中性蛋白酶的推廣與應用。

技術領域

本發明涉及基因工程與微生物改造技術領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其在中性蛋白酶生產中的應用。

背景技術

中性蛋白酶（Neutral protease）是一類在中性pH條件下作用于蛋白質肽鍵的蛋白酶，可將蛋白質水解成氨基酸、多肽以及游離氨基酸。中性蛋白酶的最適pH在7.0左右，并在pH 6.0~9.0之間保持穩定，一般分子量在35~40 kDa之間，活性中心為金屬離子。中性蛋白酶主要生產菌株有枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、米曲霉（A. oryzae）、毛霉（Mucoraceae）、棲土曲霉（Aspergillus terricola）、熱介蛋白芽孢桿菌（B. thermoprotyolyticus）、厭色鏈霉菌（St. griseus）和蜂蜜曲霉（A. melleus）等。

中性蛋白酶主要的應用市場為啤酒釀造及水產飼料。眾所周知，麥芽是啤酒釀造中最為重要的原料，其質量對于啤酒的品質有著較大的影響，但由于一些國產大麥芽溶解性較差，導致糖化過程中蛋白分解不完全、α-氨基氮不足，會降低啤酒的風味；同時，大量蛋白質的存在會與多酚類物質結合，造成麥汁渾濁，最終導致啤酒在質量上的缺陷。微生物產生的中性蛋白酶與植物蛋白酶相比，不僅能夠水解大分子蛋白質，而且可不受植物蛋白酶抑制劑影響，在麥芽糖化過程中加入，可明顯改善上述問題。與畜禽動物所不同的是水產動物的腸道pH趨于中性，因而在水產動物飼料中添加的是中性蛋白酶，可以提高水產動物的消化能力，促進其對營養物質的利用，且降低氨氮排泄。此外，中性蛋白酶還可應用于洗滌劑、釀酒釀造以及制革和醫藥等行業。

我國從上個世紀五十年代即開始了中性蛋白酶的研究，選育出一批優良菌株，如枯草芽孢桿菌AS1.398、棲土曲霉3.942等。至二十世紀八九十年代，在菌株誘變篩選、發酵工藝、分離純化等方向做了大量工作。到二十一世紀初期，開始利用基因手段研究中性蛋白酶的性能和工業應用價值。目前市場上所用的中性蛋白酶大部分來源于芽孢桿菌屬（Bacillus），但現有的中性蛋白酶生產菌種的產酶能力普遍偏低，導致中性蛋白酶的生產成本過高，嚴重限制了該酶在食品、飼料等領域的廣泛應用。

發明內容

本發明為解決現有技術問題，提供了一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）突變菌株及其在中性蛋白酶生產中的應用。申請人通過紫外誘變的方法篩選獲得的突變菌株，能大幅提高中性蛋白酶的表達量，可廣泛應用于中性蛋白酶的生產，降低該酶的成本，促進其廣泛應用。

本發明一方面提供了一種解淀粉芽孢桿菌工程菌株，其攜帶有表達中性蛋白酶的重組質粒。

所述中性蛋白酶的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:1。

本發明一方面提供了一種突變菌株解淀粉芽孢桿菌SNP（Bacillus amyloliquefaciens SNP），已于2018年11月28日保藏于中國武漢 武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2018835。

本發明一方面提供了所述解淀粉芽孢桿菌在生產中性蛋白酶中的應用。

本發明還提供了一種生產中性蛋白酶的方法，是以所述解淀粉芽孢桿菌為發酵菌株。