[發明專利]從基因工程水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白-類胰島素融合蛋白的方法

有效

• 申請號: 201811525814.1
• 申請日: 2018-12-13
• 公開（公告）號: CN111320699B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 楊代常;歐吉權
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

1.一種從基因工程水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的方法，包括以下步驟：

1)將含有重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的基因工程水稻種子與pH為7.0-7.6，含有5-20mM磷酸鹽、5-10mM醋酸鈉、0-250mM氯化鈉、10-30mM硫酸銨、10-20mM辛酸鈉、0-1mM還原型谷胱甘肽的提取緩沖液混合并靜置提取后，在pH?5.4-5.6條件下酸沉，得到含有重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的粗提取液；

2)將含有重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的粗提取液經Capto?MMC或Bestarose?Diamond?MMC復合陽離子交換層析，得到初級產物I；

其中所述復合陽離子交換層析方法為：采用pH為5.4-5.6的含有5-20mM磷酸鹽、5-20mM醋酸鈉、0-20mM檸檬酸三鈉、0-1mM還原型谷胱甘肽的平衡緩沖液，以170-240cm/h的流速平衡層析柱；

以步驟1)的粗提取液為層析上樣液，上樣結束后用所述平衡緩沖液對層析柱進行再平衡；用含有0-25mM磷酸鹽、0-20mM檸檬酸三鈉、20-40mM醋酸鈉、0-15％(V/V)異丙醇，pH為4.8-5.2的洗雜液I，以170-240cm/h的流速進行洗脫雜蛋白；

用含有0-25mM磷酸鹽、0-20mM檸檬酸三鈉，20-40mM醋酸鈉、0-15％(V/V)異丙醇，0.9-1.4M氯化鈉的pH為4.8-5.2，電導為70-89mS/cm的洗雜液II進行第二次洗雜；

以含有20mM磷酸鹽、0-20mM檸檬酸三鈉、0-20mM醋酸鈉、500mM氯化鈉、0-1mM還原型谷胱甘肽，pH為6.3-6.6的洗脫液進行洗脫，收集含有重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的洗脫液，獲得初級產物I；

3)將步驟2)的初級產物I進行進一步經Capto?Adhere或Bestarose?Diamond?Adhere復合陰離子交換層析或Cibacron?blue?F3GA親和層析純化，得到純度大于95％的重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白目標物；

其中所述復合陰離子交換層析的層析方法為：采用Adhere復合陰離子層析填料，采用pH為6.9-7.1的含有20mM檸檬酸三鈉、20mM磷酸氫二鈉、200mM氯化鈉，1mM還原型谷胱甘肽的緩沖液作為平衡緩沖液I，以120-300cm/h的流速平衡柱子；

將步驟2)的含重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的初級產物I中加入約等體積的純水，并調節pH至6.9-7.1，作為此步層析的上樣液，電導為24-29mS/cm；上樣結束后用所述平衡緩沖液I對層析柱進行再平衡；

用pH為6.9-7.1的含有20mM檸檬酸三鈉、20mM磷酸氫二鈉、200mM氯化鈉、10％(V/V)異丙醇，1mM還原型谷胱甘肽的緩沖液作為洗雜液I進行第一次洗雜；

用pH為6.9-7.1，含有20mM檸檬酸三鈉、20mM磷酸氫二鈉、200mM氯化鈉、1mM還原型谷胱甘肽的緩沖液作為平衡緩沖液II進行第二次再平衡；

用pH為5.9-6.4的含有20mM檸檬酸三鈉、20mM磷酸氫二鈉、600mM氯化鈉，1mM還原型谷胱甘肽的緩沖液作為洗雜液II進行第二次洗雜；

用pH為3.5-4.5的含有20mM檸檬酸三鈉、20mM磷酸氫二鈉、600mM氯化鈉，1mM還原型谷胱甘肽的緩沖液作為洗脫液進行洗脫，獲得純度95％以上的重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白；或者

所述親和層析的層析方法為：

采用Cibacron?blue?F3GA親和層析填料，用pH為5.0-5.8的20mM醋酸鈉作為平衡緩沖液，以120-300cm/h的流速平衡柱子；

將步驟2)的含重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白的初級產物I中加入約9倍體積的純水，并調節pH至5.0-5.8，作為此步層析的上樣液，上樣結束后用所述平衡緩沖液對層析柱進行再平衡；

用pH為6.9-7.1的含有0-20mM檸檬酸三鈉、0-20mM醋酸鈉、20mM磷酸氫二鈉、150-200mM氯化鈉的緩沖液作為洗雜液I進行第一次洗雜；

用pH為7.5-8.0，含有0-20mM檸檬酸三鈉、0-20mM醋酸鈉、20mM磷酸氫二鈉、200-900mM氯化鈉、0-1mM還原型谷胱甘肽的緩沖液作為洗雜液II進行第二次洗雜；

用pH為7.5-8.0，含有0-20mM檸檬酸三鈉、0-20mM醋酸鈉、20mM磷酸氫二鈉、1-2M氯化鈉、0-1mM還原型谷胱甘肽、0-20mM辛酸鈉的緩沖液作為洗脫液洗脫目標蛋白，獲得純度95％以上的重組人血清白蛋白-類胰島素生長因子-1融合蛋白。