[發明專利]一種產L-天冬氨酸-β-脫羧酶的基因工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201811523470.0
• 申請日: 2018-12-13
• 公開（公告）號: CN109536429A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 周哲敏;劉中美;周麗;崔文璟;郭軍玲;于佳印
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/60;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種產L?天冬氨酸?β?脫羧酶的基因工程菌及其應用，屬于生物工程領域。本發明通過構建重組大腸桿菌，獲得具有高酶活的L?天冬氨酸β?脫羧酶菌株，將重組菌株搖瓶發酵，以L?Asp?Na作為底物，進行全細胞催化反應制備L?丙氨酸。此法與化學生產法相比，生產工藝安全清潔，無環境污染，催化效率高，終產物L?丙氨酸產率96％以上，簡化產物的分離純化步驟。

技術領域

本發明涉及一種產L-天冬氨酸-β-脫羧酶的基因工程菌及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

L-丙氨酸是一種具有重要價值的氨基酸，在日化、食品和醫藥行業中有著廣泛的用途。在日化領域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性劑的原料；在食品領域，L-丙氨酸具有甜味，能與谷氨酸鈉制成混合調味品，可調制并明顯改善食品風味，而不破壞食品原有的風格；在醫藥領域，L-丙氨酸是合成維生素B6和L-氨基丙醇(鹽酸左氧氟沙星合成前體)的主要原料；同時，L-丙氨酸是復合氨基酸注射液和輸液的主要成分，也是心肌功能增強劑。

在化學合成生產中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常見思路，但該方法存在產品質量差，合成路線長，收率低，成本高，環境污染嚴重等缺點，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和發酵法制備L-丙氨酸已成為工業生產上主要采用的方法。

目前用于制備L-丙氨酸的生物合成法主要有兩種，一種是優化代謝途徑，敲除次級代謝產物編碼基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，獲得生產L-丙氨酸菌株，在培養微生物過程中合成L-丙氨酸；周麗等以野生型大腸桿菌為出發菌株，敲除代謝產物合成途徑編碼基因以及丙氨酸消旋酶編碼基因，將L-丙氨酸脫氫酶基因轉入缺陷型菌株中獲得目的菌株，該菌株發酵生產L-丙氨酸在搖瓶水平產量可達67.2g/L。另一種方法使生物酶法合成L-丙氨酸，即通過表達L-天冬氨酸-β-脫羧酶，以L-天冬氨酸作為底物，脫去β-羧基生成L-丙氨酸。編碼L-天冬氨酸-β-脫羧酶的基因Asd被發現廣泛存在于假分枝桿菌、假單胞菌、糞產堿菌、醋酸桿菌、產氣莢膜菌等微生物中。徐虹等人通過誘變獲得一株具有L-天冬氨酸-β-脫羧酶活性的假單胞菌，對底物L-天冬氨酸催化轉化率接近100％，但需要5天進行催化反應，時間過長；Wang等人在大腸桿菌異源表達Pseudomonas sp.ATCC 19121來源的Asd酶，該酶比酶活為280U/mg，比酶活很低。

因此，提供一種高產L-丙氨酸的方法、一種酶活更高的L-天冬氨酸-β-脫羧酶，對于工業應用生產L-丙氨酸具有重要的意義。

發明內容

本發明提供了一株重組來源于不動桿菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因的大腸桿菌，并以該重組大腸桿菌為催化劑，利用全細胞催化法生產L-丙氨酸。

本發明的第一個目的是提供一株大腸桿菌重組菌，異源表達了不動桿菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)來源的L-天冬氨酸β-脫羧酶。

在本發明的一種實施方式中，所述Acinetobacter sp.ACNIH2來源的L-天冬氨酸β-脫羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，以大腸桿菌BL21為宿主。

在本發明的一種實施方式中，以pET 28a(+)為表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述不動桿菌來源的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明的第二個目的是提供上述重組菌的構建方法，所述方法是將L-天冬氨酸β-脫羧酶的基因Asd與表達載體連接，轉入大腸桿菌中。

在本發明的一種實施方式中，所述方法具體是：

(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸β-脫羧酶的基因Asd；