[發明專利]一種體外重現腸道微生物組的系統及其應用方法

在審

• 申請號: 201811518985.1
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109735438A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 胡會玲;張希春;王菊霞
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12M1/26
• 分類號: C12M1/26;C12M1/24;C12M1/12;C12M1/04;C12N1/20
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

1.一種體外條件重現胃腸道微生物組的系統，其特征在于：由取樣裝置、模擬裝置、注射裝置、培養裝置，其中：取樣裝置為針管式采樣器；模擬裝置包括底部設置有超濾膜且置于離心管內的厭氧管，厭氧管頂部設置丁基膠塞，丁基膠塞上設置氮氣導管和空氣導管，氮氣導管伸入丁基膠塞內底部，空氣導管伸入至厭氧管底部； 注射裝置為連續注射器；培養裝置為恒溫搖床。

2.根據權利要求1所述的一種體外條件重現胃腸道微生物組的系統，其特征在于：所述針管式采樣器為2ml玻璃采樣器；厭氧管為2ml；離心管頂部與厭氧管過盈配合；所述超濾膜為微孔濾膜，孔徑為0.001um，耐酸堿度pH 1.0-2.5，溫度37℃。

3.利用權利要求1所述的一種體外條件重現胃腸道微生物組的系統進行重現胃腸道微生物組的方法，其特征在于：步驟如下：

（1）樣品采集：用玻璃取樣器將胃液和食物營養液按照體積比為2：1的混合液1ml注入糞便中，然后用針頭進行攪動，抽取混懸液，然后再注入糞便中，反復攪動、抽取、注入3次，最后抽取糞便、胃液和食物營養液混合物0.5ml；

（2）建立重現系統：用連續注射器將1ml食物營養液和胃液比為2:1的混合物注入厭氧管內，添加0.05M鹽酸和0.5M碳酸氫鈉，pH保持在1.0-2.5；丁基膠塞密封厭氧管，然后通入氮氣3-5s，排出空氣，管內達到無氧環境；用取樣器將步驟（1）所提取的糞便混合物注入厭氧管內，重現系統建立；

（3）胃中微生物重現：將重現系統置于恒溫搖床上，控制搖床溫度為37℃，振蕩頻率200r/min；培養時間為2-4h，培養過程中每30min抽取菌液測定其在600nm處的吸光度值，根據測量值OD值為0.8-1時培養結束；

（4）培養完成后，抽取菌液樣本，采用高通量的測序方法進行胃中微生物組的分析；

（5）小腸中微生物重現：用連續注射器向培養完成的厭氧管中加入小腸液0.5ml，加入0.5M氫氧化鈉，調節pH為6.0-7.5；然后將厭氧管置于恒溫搖床控制搖床溫度為37℃，振蕩頻率200r/min；進行腸道微生物組的培養，培養時間為4-6h；培養過程中，開始培養30min，進行第一次排氣，接下來培養過程中，每間隔1.5h進行一次排氣，直至培養結束；每次排氣完成后離心，離心速度為8000-12000r/min,離心至管內沒有液體；離心完成后對管內進行食物營養液和小腸液的補充，以及添加氫氧化鈉調節pH為6.0-7.5，培養4h后，每30min抽取一次菌液，測定其在600nm處的吸光度值，根據測量值，OD值為0.8-1時即為培養結束；

（6）培養完成后，抽取菌液樣本，采用高通量測序技術進行微生物組的分析；

其中：胃液的制備方法為：2g NaCl、3.2g胃蛋白酶，置于100mL容量瓶中，加入36.5%濃HCl 7mL，然后添加無菌蒸餾水定容至100mL，配制好的胃液置于4℃冰箱保存；

胰液的制備方法為：0.9g胰蛋白酶、6g膽汁鹽、12.5gNaHCO3，用無菌蒸餾水溶解并用1000mL容量瓶定容，配制好的胰液置于4℃冰箱保存；

食物營養液的制備方法為：月示蛋白胨（南京茂捷微生物科技有限公司）15g、胰酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、酵母浸粉5g、牛肉粉2g、消化血清粉13.5g、牛肝浸粉1.2g、葡萄糖3g、磷酸氫二鉀2.5g、氯化鈉3g、可溶性淀粉0.3g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸鈉0.15g加入1L蒸餾水中，將pH調至7.2，25℃滅菌30 min。

4.根據權利要求3所述的利用體外條件重現胃腸道微生物組的系統進行重現胃腸道微生物組的方法，其特征在于：所述模擬胃中培養2-4h；模擬小腸中培養4-6h。