[發明專利]一種蘿卜細胞質雄性不育基因分子標記引物及其應用

在審

• 申請號: 201811516672.2
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109338010A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 汪志偉;郝園園;舒黃英;楊壯;高崇倫;成善漢;朱國鵬
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

本發明公開了一種蘿卜細胞質雄性不育基因分子標記引物，該引物可以特異識別蘿卜細胞質雄性不育基因orf138，用于分子輔助選擇育種，進行蘿卜細胞質雄性不育基因orf138的基因分型。利用上述分子標記引物擴增待測蘿卜總DNA，對所得的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，當出現212bp大小的電泳條帶時，判定待測蘿卜中含有細胞質雄性不育基因orf138，表明其雄性不育表型由orf138基因導致。若未出現電泳條帶，判定待測蘿卜中不含細胞質雄性基因orf138。利用該分子標記引物，可快速鑒定蘿卜細胞質雄性不育類型，且準確率高，特異性強，方便快捷。

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種蘿卜細胞質雄性不育基因分子標記引物及其應用。

背景技術

植物細胞質雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)是一種廣泛存在于高等植物中的母性遺傳性狀，表現為植株僅僅不能產生正常的花粉。細胞質雄性不育不僅為研究核質互作提供了良好材料，同時也是植物雜交優勢利用的重要基礎，因此，植物細胞質雄性不育的研究一直受到分子遺傳學、細胞生物學、進化生物學及育種學等多個領域的廣泛關注。目前已經在玉米、水稻和小麥等作物中研究報道了大量有關細胞質雄性不育機理的研究，有關蘿卜、油菜和白菜等十字花科作物的雄性不育機理也有了一定的研究進展。自從Ogura細胞質雄性不育發現以來，國內外學者對蘿卜雄性不育分子機理進行了多方面的研究，蘿卜細胞質雄性不育類型多種多樣，不同類型的細胞質雄性不育其不育基因也不盡相同。Ogura型蘿卜細胞質雄性不育研究最為深入，研究表明蘿卜Ogura細胞質雄性不育相關的不育基因為orf138，并獲得orf138的DNA序列。

分子標記輔助育種是分子育種中的一種，其基本原理是利用分子生物學手段對目的基因或與目的基因緊密連鎖的分子標記的基因型進行分子選擇，篩選目的基因個體，從而提高育種效率，其優點是特異性強，簡捷高效。傳統蘿卜細胞質雄性不育選育主要通過表型觀察進行選育，其缺點是周期長，任務量大，速度慢。為加快蘿卜細胞質雄性不育育種效率，利用分子生物學技術，進行分子標記輔助育種十分迫切。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種蘿卜細胞質雄性不育基因orf138分子標記引物。通過檢測蘿卜細胞質雄性不育基因特異的分子標記，可以快速鑒定蘿卜細胞質雄性不育類型，為開展蘿卜細胞不育分子標記輔助育種奠定基礎。

本發明的目的通過以下技術方案來實現：根據不育基因orf138的序列特征，設計了用于檢測蘿卜細胞質雄性不育基因的分子標記引物，所述分子標記引物的上游引物具有如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列，為5’-GTATGGGTGGCTAGGTGTCA-3’，下游引物具有如SEQID NO：2所示的核苷酸序列，為5’-TCGGTCCATTTTCCACCTCT-3’。

進一步地，使用所述的分子標記引物對待測蘿卜總DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳條帶判定待測蘿卜是否含有細胞質雄性不育基因orf138，若出現一條212bp的特異片段，則表明待測蘿卜中含有orf138基因，若未出現條帶則表明不含orf138基因。

上述特異片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，為：

GTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGA。

進一步地，所述PCR擴增的反應體系為25μl，具體為DNA模板40ng，2×Taq-mix12.5μl，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM。