[發明專利]一種在線粒體中定位表達外源蛋白的方法

有效

• 申請號: 201811512195.2
• 申請日: 2018-12-11
• 公開（公告）號: CN109777807B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 王文斐;郭澤軍;楊雪蓮;張哲
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/65;C07K14/415
• 代理公司: 廈門智慧呈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 35222
• 代理人: 楊玉芳

本發明一種在線粒體中定位表達外源蛋白的方法，屬于分子遺傳學領域，提供了一種編碼多肽的DNA序列及其可在線粒體中定位表達外源蛋白的應用和相關方法。具體涉及一段來自毛竹基因組的序列，它所編碼的一段多肽可以將外源蛋白表達在線粒體，可作為線粒體共定位的標記基因，為亞細胞定位的提供了一種可靠的比對方法。本發明首先克隆了一段毛竹基因的序列，將其連接在C端的黃色熒光蛋白導入了線粒體。將轉運肽與熒光蛋白融合，能夠在活細胞中進行觀察，省時省力，是研究蛋白功能的一種基礎方法。

技術領域

本發明屬于分子遺傳學領域，提供了一種編碼多肽的DNA序列及其可在線粒體中定位表達外源蛋白的應用和相關方法。

背景技術

線粒體是幾乎所有真核細胞中發現的必需細胞器，參與多種關鍵細胞過程，如能量轉換，細胞信號傳導，細胞周期調控和細胞分化^[1]。絕大多數線粒體蛋白質組是細胞核編碼，翻譯在細胞質中，隨后進入線粒體。靶向新合成的蛋白質并將其導入正確的細胞器需要存在細胞器特異性靶向信號，并涉及復雜的細胞內蛋白質運輸機制，包括不同的細胞溶質因子，分子伴侶和細胞器特異性轉位酶[1]。大多數用于導入線粒體基質的蛋白質在其N末端具有靶向信息。這些基質靶向序列(MTS)通常長度為20-60個氨基酸，并且在通過線粒體加工肽酶 (MPP)導入線粒體時被切割^[2,3]。然而，線粒體輸入信號也存在于蛋白質的其他位置，已知這種信號是存在的^[4,5]。線粒體靶向肽富含帶正電荷的殘基(特別是精氨酸)，缺乏帶負電的殘基，并且具有形成雙親和性α-螺旋的能力^[6]。雙親和性結構對于結合線粒體外膜中的受體很重要，并且在ΔΨ驅動的線粒體內膜導入過程中可能需要正電荷[7]。ScCOX4被發現是酵母細胞中線粒體的靶位信號后廣泛被應用為線粒體marker基因[8]，本研究使用的CoxⅣ-mCherry熒光特異標記線粒體。

現有技術存在的問題：

蛋白的定位往往與蛋白的功能相關，目前還不能完全根據蛋白的序列來確定蛋白所表達的位置。需要通過實驗來確定。在實驗過程中對于在細胞中的點狀分布的信號，很難確切的判斷信號的表達位置。所以在亞細胞定位時通常需要一些亞細胞定位的marker來做對照，本研究報導了一段來自毛竹基因組的序列，它所編碼的一段多肽可以將外源蛋白表達在線粒體，可用于線粒體表達的 marker基因。

參考文獻：

[1].Neupert,W.,A Perspective on Transport of Proteins intoMitochondria:A Myriad of Open Questions.JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,2015.427(6SIA):p. 1135-1158.

[2].Bohni,P.C.,G.Daum and G.Schatz,Import of proteins intomitochondria.Partial purification of a matrix-located protease involved incleavage of mitochondrial precursor polypeptides.The Journal of biologicalchemistry,1983.258(8):p. 4937-43.

[3].Hawlitschek,G.,et al.,Mitochondrial protein import:identificationof processing peptidase and of PEP,a processing enhancing protein.Cell,1988.53(5):p.795-806.