[發(fā)明專利]一種金屬親和性融合蛋白標(biāo)簽及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811501272.4
• 申請(qǐng)日: 2018-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN109929023B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王楠;王燕;潘微彤;雷瓊;沈蒼頡;宋曉涵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所
• 主分類號(hào): C07K14/47
• 分類號(hào): C07K14/47;C07K19/00;C07K1/22;C12N15/12;C12N15/62
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本發(fā)明公開了一種新型金屬親和性融合蛋白標(biāo)簽，該標(biāo)簽來(lái)源于天然的人銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白胞外氨基端片段，可替代His?tag作為金屬親和標(biāo)簽，用于純化重組融合蛋白；還公開了融合該標(biāo)簽的新型融合蛋白，其具有特殊的生理、藥理活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)金屬離子有親和能力的新型金屬親和性融合蛋白標(biāo)簽，及其融合蛋白。

背景技術(shù)

金屬螯合親和層析，又稱固定化金屬離子親和層析。該方法利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸等殘基的金屬離子結(jié)合特性，通過固相基質(zhì)的吸附作用來(lái)分離、純化蛋白質(zhì)。組氨酸標(biāo)簽(His-Tag)作為一種人工合成的序列，可用于外源蛋白的融合表達(dá)，以利于重組蛋白的純化。在目的蛋白的氨基端、羧基端或中間，融合連續(xù)組氨酸殘基組成的肽段(常用6-10個(gè)組氨酸)，均可在多種表達(dá)系統(tǒng)(細(xì)菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中成功表達(dá)。His-Tag相較于其他融合蛋白標(biāo)簽如GST等，分子量小，應(yīng)用廣泛。

已有研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端融合His-tag會(huì)影響蛋白質(zhì)的復(fù)性[1]、穩(wěn)定性[2]或溶解度[3]；His-tag也可能影響蛋白質(zhì)的活性，如His-tag融合于Chlorocatchol1,2-Dioxygenase(CCD)的氨基端，其結(jié)構(gòu)與CCD雖然只有微小區(qū)別，活性卻降低5倍[4]。另外，His-tag不是內(nèi)源性蛋白，具有一定的免疫原性，因此體內(nèi)應(yīng)用的目的蛋白如藥物蛋白，通常需要在純化后切除His-tag。

人銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(human copper transporter，hCtr)是人體內(nèi)具有銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白,分為hCtr1、hCtr2型。相比于hCtr2，hCtr1對(duì)銅離子有較高親和力，主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞外環(huán)境中的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。hCtr1在所有的組織和器官中均有表達(dá)，但表達(dá)的量有所不同，在肝臟和腎臟中表達(dá)最多，在腦和骨骼肌中表達(dá)相對(duì)較少[5]。hCtr1單體的分子量為28kD，由190個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括氨基端(66個(gè)氨基酸殘基)，位于質(zhì)膜外側(cè)，包含蛋氨酸與組氨酸富集區(qū)；三段螺旋跨膜區(qū)，其中第二跨膜區(qū)存在蛋氨酸富集區(qū)；一段較長(zhǎng)的連接第一、第二跨膜區(qū)的胞內(nèi)自由肽(47個(gè)氨基酸殘基)；以及胞內(nèi)羧基端(15個(gè)氨基酸殘基)，存在His-Cys-His序列，結(jié)構(gòu)見圖23所示。hCtr1以同源三聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)膜上，形成錐形空隙通道，供銅離子通過進(jìn)入細(xì)胞[6]。

hCtr1蛋白氨基端的兩個(gè)蛋氨酸富集區(qū)，構(gòu)成MXXM或MXM的特征序列，其中第二個(gè)蛋氨酸富集區(qū)中45位蛋氨酸在銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用，該區(qū)選擇性親和還原型Cu⁺，可達(dá)微摩爾水平[7]，同時(shí)其對(duì)hCtr1的氨基端自聚是必要的[8]。此外，hCtr1胞外氨基端還包含H2N-MDH即ATCUN(amino terminal Cu²⁺and Ni²⁺binder)結(jié)合位點(diǎn)，以及組氨酸富集區(qū)[9]。ATCUN結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)氧化型Cu²⁺有很高親和力，可達(dá)到皮摩爾水平，而5、6位的His形成bis-His結(jié)構(gòu)可促進(jìn)抗壞血酸還原二價(jià)銅離子，并可與一價(jià)銅離子形成相對(duì)不穩(wěn)定的配位鍵，后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程可持續(xù)進(jìn)行[10]。

每個(gè)hCtr1單體含三段跨膜區(qū)域，其中第二段跨膜區(qū)位于孔隙的中央。在第二跨膜區(qū)的靠近磷脂雙層膜外側(cè)的MXXXM特征序列構(gòu)成蛋氨酸富集區(qū)，協(xié)助銅離子的在孔道的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)第二跨跨膜區(qū)的139位組氨酸不參與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)而對(duì)三聚體的形成起重要作用[11]。第二段跨膜區(qū)與第三段跨膜區(qū)僅通過胞外三個(gè)氨基酸殘基相連，其中第三段跨膜區(qū)的GXXXG保守片段與第三和第一跨膜區(qū)螺旋的緊密堆積有關(guān)[12]。細(xì)胞內(nèi)羧基端特別是189位半胱氨酸影響hCtr1同源三聚體的形成，但不會(huì)對(duì)銅轉(zhuǎn)運(yùn)的速率造成影響，原因是突變189位半胱氨酸后，組氨酸可替代半胱氨酸參與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)[12,13]?？梢奾Ctr1的胞外氨基端、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)段均參與了由同源三聚體組成的跨膜孔隙的形成，以及銅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。