[發(fā)明專利]一種在油松下胚軸中進行基因瞬時表達的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811496734.8
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109402167A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 馬晶晶;鈕世輝;李悅;李偉;劉雙委
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權代理有限公司 11246
• 代理人: 苗艷榮

本發(fā)明公開了一種在油松下胚軸中實現(xiàn)基因瞬時表達的方法，包括以下步驟：1)油松下胚軸的預處理；2)油松下胚軸組織預侵染的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)和處理；3)將下胚軸組織浸泡于導入了35S:Gus基因序列的農(nóng)桿菌侵染溶液；4)超聲波處理組織實現(xiàn)基因轉入；5)下胚軸組織侵染后的繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明建立的基因瞬時表達方法能夠較高效地實現(xiàn)基因在油松下胚軸中表達，操作簡單且結果可靠，可為油松基因功能驗證和調(diào)控關系研究提供技術支持。

技術領域

本發(fā)明屬于植物分子生物技術和基因工程領域，具體地說，涉及一種在油松下胚軸中進行基因瞬時表達的方法。

背景技術

近年來，植物分子生物學研究不斷深入，越來越多基因的功能被解析，各種作用機制也被深入探索，其中，由農(nóng)桿菌介導的基因異源表達實驗應用十分廣泛。在傳統(tǒng)農(nóng)桿菌轉染植物使得基因穩(wěn)定表達的實驗中，外源T-DNA整合到被轉染植物的基因組中，并在第十到十四天表達量升高，并且這種表達量增高跟整合了T-DNA的植物細胞的增殖相關。然而，通過穩(wěn)定的基因表達，轉基因植物的產(chǎn)生需要大批量實驗材料的繁殖且十分耗時。另外，由插入位置或其他因素引起的可變轉基因表達也增大了數(shù)據(jù)分析的復雜性。

基因瞬時表達可以有效地研究基因表達的蛋白質(zhì)在組織中的定位、功能以及病原體和宿主或非宿主之間的相互作用。瞬時表達后，目標基因的表型可以在幾個小時或者幾天內(nèi)觀察到，十分高效。一般在2-4天內(nèi)表達量達到高峰隨后會由于轉化的細胞代謝而下降。

基因瞬時表達可以通過很多種方法實現(xiàn)：原生質(zhì)體電擊(分離原生質(zhì)體不易)、基因槍(需要表達量特別高且不同實驗室和樣本差異很大)、農(nóng)桿菌介導的結合、病毒載體介導的插入(會被植物樣本免疫且插入片段大小有限制)和顯微注射(基因沉默率很高)。而農(nóng)桿菌介導的基因瞬時表達沒有其他方式的限制，并且農(nóng)桿菌會感染無數(shù)個組織的細胞，這使得轉化效率得到極大的提高。

近年來，包括煙草、擬南芥、小麥、水稻等在內(nèi)的許多被子植物的器官或組織，包括葉子、花、針、樹皮、莖或根，都成功地通過農(nóng)桿菌介導的進行基因轉化。基因瞬時表達在被子植物中的廣泛應用表明在植物中進行由農(nóng)桿菌介導的瞬時轉變是被科學研究人員所接受的。然而，在諸如油松等裸子植物組織中，還未對瞬時表達進行深入研究與應用。

油松作為我國特有的鄉(xiāng)土樹種，其耐干旱、耐瘠薄的特點也使其成為北方主要的造林和用材樹種。目前，在油松傳統(tǒng)育種和種質(zhì)選優(yōu)方面已經(jīng)開展了許多研究，但其功能基因鑒定、遺傳機制解析等方面還亟待深入研究。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對提供了一種在油松下胚軸中進行基因瞬時表達的方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種在油松下胚軸中進行基因瞬時表達的方法，包括以下步驟：

1)油松下胚軸的預處理；

2)油松下胚軸組織預侵染的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)；

3)制備侵染溶液；

4)將1)中得到的下胚軸組織浸沒于3)中得到的包含農(nóng)桿菌和表面活性劑的侵染溶液中，使用的農(nóng)桿菌轉入了35S:Gus基因；

5)用超聲波處理4)中的溶液，將Gus基因轉入下胚軸細胞；

6)下胚軸組織侵染后再培養(yǎng)，實現(xiàn)Gus基因的瞬時過量表達。

可選地，步驟1)中油松下胚軸的預處理具體為選取種子進行萌發(fā)1周，將子葉還未完全展開時的油松幼苗6-10株捆成一捆，垂直橫切成1-2cm的片段，并用無菌水沖洗2-3次。