[發明專利]一種產L-異亮氨酸的基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201811493910.2
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109536428B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 蘇海霞;朱程軍;邢盼盼;王炯;李敬;皮莉;左江;黃治華;魯凡
• 申請（專利權）人: 武漢遠大弘元股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/77;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;黃益澍

1.一種產L-異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其特征在于，其在出發菌株基因組中敲除了編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了編碼天冬氨酸激酶的lysC操縱子，所述lysC操縱子含lysC突變基因、其5’端的啟動子和3’端的終止子，其中所述lysC突變基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出發菌株為保藏號為CCTCC NO:M2016609的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC。

2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述啟動子為來源于出發菌株基因組的pgro啟動子，所述終止子為來源于大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體PXMJ19的rrnB終止子，所述lysC操縱子的序列如SEQ ID No:4所示。

3.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述編碼天冬氨酸激酶的lysC操縱子插入在ddh基因敲除的位點上。

4.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述編碼天冬氨酸激酶的lysC操縱子插入在ddh基因敲除的位點上；所述插入形成如SEQ ID No:5所示的核苷酸序列，由此制得基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。

5.一種如權利要求1-4任一項所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，其包括以下的步驟：

(1)在保藏號為CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC出發菌株基因組敲除ddh基因，置換為如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，獲得C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株；

(2)在步驟(1)獲得的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株基因組上插入lysC操縱子，獲得所述基因工程菌。

6.一種L-異亮氨酸的制備方法，其特征在于，其包括以下的步驟：發酵培養權利要求1-4任一項所述的基因工程菌以產生L-異亮氨酸。

7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述發酵培養的溫度為29～33℃；溶解氧為15～30％，所述％為體積百分比；發酵時間為至少55小時；和/或，氨水調節發酵培養基的pH為6.5～7.0。

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，發酵培養時流加50～80％葡萄糖溶液，控制發酵培養基殘糖量為1.5～2.5％。

9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述發酵培養基為：葡萄糖16.0％、硫酸銨0.8％、玉米漿3.5％、酵母膏0.3％、絲肽粉0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、維生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸鐵0.00001％、丙氨酸0.004％；余量為去離子水，pH為7；所述％為重量體積百分比。

10.一種重組載體，所述重組載體在多克隆位點上整合了lysC操縱子，所述lysC操縱子含lysC突變基因、其5’端的啟動子和3’端的終止子，其中所述lysC突變基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

11.如權利要求10所述的重組載體，其特征在于，所述啟動子為來源于出發菌株基因組的pgro啟動子，所述終止子為來源于大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體PXMJ19的rrnB終止子，所述lysC操縱子的序列如SEQ ID No:4所示。