[發(fā)明專利]一種快速檢測大腸桿菌中乙醇酸產(chǎn)量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811493415.1
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109520985B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧禹;朱康佳;李國輝;毛銀;趙運英
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種快速檢測大腸桿菌中乙醇酸產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用順式反應(yīng)元件的特征，構(gòu)建了乙醇酸傳感器質(zhì)粒，利用glcD基因的上游(?195～+56)片段作為熒光蛋白基因sfGFP的啟動子。將質(zhì)粒導(dǎo)入到生產(chǎn)乙醇酸的工程菌株中，當(dāng)培養(yǎng)基中中含有乙醇酸或者發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇酸時，即可誘導(dǎo)傳感器質(zhì)粒上sfGFP基因的表達，使細胞產(chǎn)生熒光。本發(fā)明的方法測定準(zhǔn)確度達0.9435，可提高檢測效率，相比于HPLC檢測方法，可同時測定100個樣品，檢測時間縮短為1min。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速檢測大腸桿菌中乙醇酸產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

利用微生物生產(chǎn)化學(xué)品是目前化學(xué)合成最有前景的替代手段。微生物體內(nèi)目的產(chǎn)物的檢測是微生物代謝工程的很重要的一步。現(xiàn)在普遍運用的HPLC、LC-MS、Western blot等檢測技術(shù)不僅繁瑣而且不能及時反應(yīng)產(chǎn)物濃度。特別是在高通量篩選高產(chǎn)菌株的過程中，產(chǎn)物濃度檢測大大限制了篩選的效率。

生物傳感器是目前具有開發(fā)前景的一種產(chǎn)物檢測模式，并可以用作高通量篩選的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明運用小分子轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建基因編碼的生物傳感器，使細胞內(nèi)的目標(biāo)代謝物濃度與熒光讀數(shù)成比例，能夠通過觀察熒光強度來顯示產(chǎn)物的產(chǎn)量。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種快速檢測大腸桿菌乙醇酸產(chǎn)量的方法，所述方法向大腸桿菌中引入生物傳感器，以生物傳感器表達的熒光強度表征大腸桿菌的乙醇酸產(chǎn)量；所述生物傳感器含有g(shù)lcC基因及其啟動子、glcD基因的啟動子及熒光蛋白基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述glcC基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述glcC基因的啟動子Pct序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述glcD基因的啟動子序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述熒光蛋白基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述生物傳感器是含有g(shù)lcC基因及其啟動子、glcD基因的啟動子及熒光蛋白基因的質(zhì)粒。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述質(zhì)粒是以pJKR-H-cdaR為出發(fā)質(zhì)粒，引入glcC基因及其啟動子、glcD基因的啟動子及熒光蛋白基因，命名為pGBS-H-glcC。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述質(zhì)粒是以PCOLADuet1為出發(fā)質(zhì)粒，引入glcC基因及其啟動子、glcD基因的啟動子及熒光蛋白基因，命名為pGBS-L-glcC。

在本發(fā)明的一種實施方式中，乙醇酸濃度為0-50mM時，應(yīng)用pGBS-L-glcC進行檢測。

在本發(fā)明的一種實施方式中，乙醇酸濃度為0-1mM時，應(yīng)用pGBS-H-glcC進行檢測。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測大腸桿菌乙醇酸產(chǎn)量的生物傳感器，所述生物傳感器含有g(shù)lcC基因及其啟動子、glcD基因的啟動子及熒光蛋白基因。

本發(fā)明還要求保護所述生物傳感器在檢測乙醇酸代謝途徑相關(guān)產(chǎn)物方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述乙醇酸代謝途徑相關(guān)產(chǎn)物包括但不限于乙酸。