[發明專利]一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201811493223.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109629007A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 扶媛媛;周洋;曹彥東;楊穎
• 申請（專利權）人: 北京安智因生物技術有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 北京國之大銘知識產權代理事務所(普通合伙) 11565
• 代理人: 張偉鳳

1.一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)DNA質量標準：受試者樣本的基因組DNA，經過核酸提取、質量檢測后，要求基因組DNA符合相應的控制標準；

(2)目標區域擴增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修飾的相應引物組，對目標區域進行PCR擴增；

(3)測序標簽連接：在DNA連接酶作用下利用上述步驟(2)的PCR產物連接高通量測序平臺專用測序標簽，測序標簽含有區分樣本的特異性標簽序列；

(4)文庫純化：步驟(3)的產物中加入純化磁珠后混勻純化；

(5)產物洗脫及擴增：在上述步驟(4)中加入PCR擴增預混液，進行PCR擴增反應；

(6)擴增產物純化：在上述步驟(5)的PCR產物中加入磁珠純化即得文庫；

(7)文庫質檢：使用Qubit熒光計對步驟(6)中文庫進行定量質檢。

2.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，上述步驟(1)中所述的DNA質控標準為，采用Qubit熒光計測量DNA濃度≥1ng/μL；DNA純度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2；DNA總起始量:2ng。

3.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的目標區域包含以下基因的編碼氨基酸的外顯子區域及外顯子上下游各20堿基區域：F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1。

4.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，步驟(2)中進行目標區域PCR擴增的引物組為兩個獨立的引物組，分別進行目標區域擴增，每個引物的擴增產物長度均在125-275bp。

5.如權利要求4所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，每個獨立的引物組反應體系為5-10μL，2個引物組總反應體積為10-20μL；目標區域擴增反應體系按照下述體積比組成擴增體系PCR擴增預混液：引物組：DNA＝1:1:3；反應條件：99℃保持2min；然后進行16～19個循環，每個循環為99℃15s，60℃4～8min；最后保持在10℃不超過12h。

6.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，所述步驟(3)中將步驟(2)得到的兩個獨立引物組擴增產物混合，加入連接酶、連接預混液、測序標簽，其體積比為1:2:1；反應條件：22℃保持30min；72℃保持5～10min；最后保持在10℃不超過1h。

7.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，步驟(4)中所述連接反應產物與純化磁珠的體積比為1:1.5；步驟(6)中PCR產物與純化磁珠的體積比為1:0.5:1.2。

8.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，步驟(5)中所述再擴增反應條件：98℃保持2min；然后進行5-10個循環，每個循環為98℃15s，64℃1min；最后保持在10℃不超過12h。

9.如權利要求1所述的一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，步驟(7)使用Qubit熒光劑進行文庫定量質檢：兩個獨立引物組的擴增產物均在125-275bp，結合Ion平臺測序標簽后，平均長度為275bp，18ng/mL為100pM。

10.一種遺傳性出凝血的基因文庫構建方法，其特征在于，包括權利要求1-9任意一項中所述的基因檢測文庫的建庫試劑及引物組序列，所述引物序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO288。