[發(fā)明專利]一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物設計方法、引物、試劑盒、方法和系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811492690.1
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109337973B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設計）人: 劉洪洲;喻長順;熊見見;趙薇薇;于世輝
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司;廣州金域醫(yī)學檢驗集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;劉飛

本發(fā)明提供了一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物設計方法，本發(fā)明還提供了一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物、方法和系統(tǒng)，相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明引物設計方法中設計引物的區(qū)域增加，不再局限于80bp至150bp，引物設計難度大大減小。本發(fā)明驗證方法中測序結(jié)果非常直觀，對缺失變異的判斷比較方便。采用本發(fā)明的引物設計方法、驗證引物、驗證方法和驗證系統(tǒng)可以避免同源性對驗證的影響；采用本發(fā)明的驗證方法和驗證系統(tǒng)不僅可以確定CNV是否存在，還可以確定CNV與微小變異是否處于同一條染色體上。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物設計方法、引物、試劑盒、方法和系統(tǒng)。

背景技術(shù)

人類染色體有46條，其中常染色體有22對，是成對出現(xiàn)的，每對染色體中，一條來自于父方，一條母方，叫做同源染色體。染色體主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，其中DNA即脫氧核糖核酸序列(又稱為核苷酸序列或堿基序列)決定著遺傳信息。DNA是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸，即腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脫氧核苷酸(dCMP)、鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP)。決定生物的多樣性的就是脫氧核苷酸中四種堿基，腺嘌呤(adenine，A)，胸腺嘧啶(thymine，T)，胞嘧啶(cytosine，C)和鳥嘌呤(guanine，G)，DNA序列通常用ATCG四種堿基的序列來表示，稱為堿基序列或核苷酸序列，A與T配對，C與G配對，正向是指5’端到3’端方向。

基因變異是指基因組DNA分子發(fā)生的可遺傳的變異，根據(jù)變異涉及片段大小，可分為微小變異和拷貝數(shù)變異，其中拷貝數(shù)變異(Copy number variations, CNVs)是指長度大于1kb的DNA片段的缺失或重復變異。CNVs檢測的方法有多種，比如染色體微陣列芯片技術(shù)(chromosomal microarray,CMA)、單核苷酸基因分型技術(shù)、多重連接探針擴增技術(shù)(Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)以及目前已經(jīng)被臨床研究廣泛應用的高通量測序技術(shù)。

對于像CMA、高通量測序等檢測到的CNVs，往往需要用其他方法進一步驗證，常用的方法有MLPA、半定量qPCR等。其中qPCR是最常用的方法之一，但是，qPCR擴增長度要求嚴格，通常為80bp至150bp，當目的片段存在較高的同源性時，引物設計困難而極容易失敗，進而驗證失敗。而MLPA是試劑公司開發(fā)的成品試劑，大多基因并沒有相應探針。其中一種情形是，檢測到一個雜合微小變異，同時，其附近又檢測到一個雜合缺失CNV，此時，同源性很高時，通過qPCR往往很難驗證CNV的存在狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物設計方法，基本該引物設計方法，本發(fā)明還提供了一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物、試劑盒、方法和系統(tǒng)，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種用于驗證特定DNA片段拷貝數(shù)變異的引物設計方法，所述引物設計方法包括以下步驟：

針對已知存在雜合微小變異且可能存在雜合缺失拷貝數(shù)變異的待驗證特定 DNA片段，設計至少一對用于檢測所述雜合微小變異的引物，其中設計的引物對中的一條引物位于微小變異的上游或者下游，另一條引物位于待驗證缺失拷貝數(shù)變異區(qū)域，設計的引物對為用于驗證DNA片段拷貝數(shù)變異的引物。

雜合微小變異是指在同源染色體中的一條染色體上存在微小變異，而另一條染色體對應位置上不存在該微小變異。雜合缺失拷貝數(shù)變異是指在同源染色體中的一條染色體上存在缺失拷貝數(shù)變異，而另一條染色體對應位置上不存在該缺失拷貝數(shù)變異。