[發(fā)明專利]一種基于病毒樣顆粒的C型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811492145.2
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109799345B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫世琪;白滿元;郭慧琛;張韻;茹嘉喜;楊志元
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張晉

1.一種C型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒，檢測試劑盒內(nèi)包括有：包被C型口蹄疫病毒樣顆粒的酶標(biāo)版、HRP標(biāo)記的兔抗、含有吐溫和磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液和含有吐溫和磷酸鹽緩沖液的洗滌液、TMB底物、陽性對照血清、陰性對照血清、以及濃硫酸與水混合的終止液，其特征在于酶標(biāo)板包被的C型口蹄疫病毒樣顆粒是由C型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP1和VP3組裝而成的C型口蹄疫病毒樣顆粒；C型FMD VLPs的制備步驟為：

1.1 目的蛋白的表達(dá)及純化

（1）將C型陽性重組質(zhì)粒p-SMK-VP0VP3和p-SMK-VP1共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)-RIL，表達(dá)菌按1:100的比例接種到含有10 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL氨芐青霉素和25 μg/mL氯霉素的經(jīng)高壓滅菌的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.6~0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，并于16℃條件下誘導(dǎo)16 h；

C型陽性重組質(zhì)粒p-SMK-VP0VP3和p-SMK-VP1序列中，VP0、VP3和VP1的序列分別為：SEQID No.1 、SEQ ID No.3和 SEQ ID No.2.；

（2）4℃ 4000 r/min離心30 min收集菌體，超聲破碎20～24 min，4℃ 11000 r/min離心30 min收集上清；

（3）將上清與已平衡好的Ni²⁺親和層析柱于4℃結(jié)合1 h，棄掉流穿液，先用10個(gè)柱體積Buffer A洗液洗脫雜蛋白，Buffer A洗液為20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，3‰TritonX-100，pH=8.0，然后Buffer B洗液將目的蛋白洗脫，Buffer B洗液為20mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mM咪唑，3‰TritonX-100，pH 8.0；

（4）收集洗脫液，然后用SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)鑒定得到的蛋白，測定蛋白濃度后于-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 VLPs的體外組裝

將帶有His-SUMO標(biāo)簽的目的蛋白與SUMO酶按100:1的比例于透析袋中，在500 mL的酶切緩沖液中，4℃過夜酶切和組裝，收集VLPs，進(jìn)行SDS-PAGE和WB鑒定，于-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

將VLPs室溫吸附到碳膜包被的銅網(wǎng)上5min，用濾紙吸去銅網(wǎng)上多余的液體，用3%的磷酸鎢負(fù)染5 min后，濾紙吸去多余液體，最后在透射電鏡下觀察樣品VLPs，大小20-40nm，DLS檢測的VLPs直徑與TEM的一致。

2.權(quán)利要求1所述的C型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于HRP直接標(biāo)記在跟被檢抗體同時(shí)作用的競爭性抗體上，其制備過程包括：用C型口蹄疫病毒樣顆粒免疫兔，免疫結(jié)束后，從兔心臟采血，分離血清并用Protein A親和層析法分離純化得到IgG，采用過碘酸鈉方法將HRP標(biāo)記到IgG上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的C型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于其中的酶標(biāo)板制備是用0.05% pH=9.6的碳酸鹽包被緩沖液將C型FMDV VLPs稀釋為5 μɡ/mL，以每孔100 μL的量加入酶標(biāo)板，4℃包被過夜，洗滌液洗板3次；加入以酶標(biāo)板穩(wěn)定劑配制的含1%BSA封閉液，每孔120 μL，37℃恒溫箱封閉1 h，洗板3次，干燥，真空包裝。